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伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）属疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型，它能导致多种家畜和野生动物发生急性传染病。猪是该病毒的贮存者和传染源，猪感染PRV后常表现为神经系统的功能紊乱和呼吸系统疾病并引起严重的繁殖障碍。该病已给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失，预防、控制而最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。而伪狂犬病病毒具有较强的潜伏感染性，从而给伪狂犬病的根除带来了相当大的困难。本研究之一则对与该病毒的潜伏激活有密切关系的EPO基因进行了克隆、测序和表达。伪狂犬病病毒EPO基因位于病毒基因组的独特长区末端，是一个早期蛋白基因，其氨基酸末端具有典型的环指结构区域，它与人的单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-1）的ICPO基因同源，能转录激活TK、gG等基因的启动子，它对伪狂犬病病毒的复制是非必需的，但在伪狂犬病病毒的潜伏激活中可能起着十分重要的作用。本实验以伪狂犬病病毒Ea株（PRV-Ea）细胞感染物为模板，PCR扩增出1.23kb的EPO基因完整编码区片段，将该基因片段克隆到pBluescriptⅡ sk+中并构建三个测序质粒，双脱氧末端终止法测定序列并同国外InFh株进行同源比较，发现PRV-Ea EPO基因存在多处点突变和一处缺失突变，但无插入突变和移码。进一步将该片段插入原核表达载体pET-28a的His-Tag下游，构建的原核表达质粒pET-EPO在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导获得了高效表达，分离包涵体，经SDS-PAGE电泳结果显示，表达的蛋白分子量为62KD，并形成包涵体。Western印迹分析表明，该蛋白带能与Ea株野毒高免血清发生特异性反应。证实PRV-Ea EPO基因在BL21（DE3）中获得了正确表达，并且具有免疫学活性。同时，将EPO基因克隆到高效真核表达载体pcDNA3.1+的EcoRI和XbaI位点之间，构建了EPO的真核表达质粒pcDNA-EPO。体外转染IBRS-2细胞，经G418筛选，得到阳性pcDNA-EPO克隆细胞，经酶联免疫吸附实验（ELISA）检测证实了EPO基因在IBRS-2细胞中得到了表达，表达的蛋白具有生物学活性。本实验为进一步研究EPO基因的功能以及伪狂犬病病毒的潜伏感染奠定了基础。伪狂犬病病毒鄂A株EPO基因的克隆、表达及转移载体pUSKvP，的构建 伪狂犬病病毒与猪细小病毒均是引起猪繁殖障碍的主要病原，二者在临床上常发生混合感染，因此研制这两种病的基因重组疫苗在生产实践中具有十分重要的意义。伪狂犬病病毒基因组为一双链DNA，在长约1 50kb的基因组上存在许多与病毒复制无关的非必需基因可供外源基因的插入，而使之能成为活载体疫苗。本研究之二则设计一对上、下游分别含石匕月Jl位点的引物尸CR扩增猪细小病毒的免疫结构蛋白VPZ基因，再将其克隆到质粒pUSK中gG启动子下游的撇川工位点，从而构建了转移载体pUSKVPZ。为进一步将VP:基因整合到伪狂犬病病毒TK一/gG一缺失株基因组中，构建以伪狂犬病病毒TK一/gG一缺失株为载体表达猪细小病毒VPZ基因的猪伪狂犬病一猪细小病双价基因重组疫苗打下基础。