论文部分内容阅读
分子伴侣(chaperone)在生物体内参与帮助新合成蛋白的折叠、蛋白跨膜运输和多聚体的组装与解组装等一系列质量控制过程。分子伴侣素(chaperonin)是一类非常保守的分子伴侣，普遍存在于生物体的不同组织器官中。类型一分子伴侣素依赖其辅分子伴侣素行使其功能，存在于真细菌(GroEL)，线粒体(Hsp60)以及叶绿体(Cpn60)中。大肠杆菌GroEL由14个相同亚基组成，每7个亚基形成一个中空的杯状环，两个杯状环背靠背排布形成对称的14聚体的桶状结构。而7个相同10 kD亚基组成的辅分子伴侣素(GroES)形成类似盖子的结构，对称结合于GroEL中空的桶状结构的两端。这样GroEL与GroES之间就会形成一个空腔，小于50 kD的底物的折叠一般在这个空间内发生。与GroEL不同，叶绿体Cpn60复合体由两种不同亚基类型组成，分别为Cpn60α和Cpn60β。研究发现，在不同物种中每种类型包含几种不同亚基。与GroEL相似，高等植物叶绿体Cpn60也需要辅分子伴侣素的协助才能执行其功能。植物叶绿体中存在两类辅分子伴侣素:类型一辅分子伴侣素分子量与GroES类似，称为Cpn10。体外实验表明Cpn10与GroES具有类似的结构和功能，可以形成7重对称的环状结构与分子伴侣素相互作用。类型二辅分子伴侣素可以看作是由两个Cpn10首尾串联组成，其分子量约20 kD，称为Cpn20。体外实验表明Cpn20形成四聚体，具有辅分子伴侣素的功能。目前，关于叶绿体内分子伴侣素Cpn60的组成，功能以及与辅分子伴侣素的协同作用研究还不清楚。 在模式生物莱茵衣藻叶绿体中，含有一个Cpn60α基因和两个Cpn60β基因（Cpn60β1和Cpn60β2），以及三个辅分子伴侣素基因，分别是Cpn10、Cpn20和Cpn23。任一莱茵衣藻辅分子伴侣素不能单独与GroEL相互作用折叠底物，但两种或者三种辅分子伴侣素形成的杂合复合体具有典型的GroES功能。我们利用莱茵衣藻叶绿体内Cpn60系统亚基相对较少的特点，系统的探究Cpn60与Cpn20的协同作用。 在体内，Cpn60蛋白质亚基主要是以大约800kD的复合体存在的，少量的亚基以单体形式存在。通过免疫共沉淀方法分离出Cpn60复合体，质谱鉴定表明三种蛋白亚基都参与复合体的形成。体外单独表达或者共表达三种蛋白质亚基能够纯化得到三种Cpn60复合体:同源寡聚体Cpn60β1、Cpn60β2以及异源寡聚体Cpn60αβ1β2。但只有Cpn60αβ1β2与辅分子伴侣素GroES相互作用折叠模式底物Rubisco，表明莱茵衣藻叶绿体内的Cpn60是由三种亚基组成的功能复合体。文献报道，单独的衣藻Cpn20不能与GroEL相互作用折叠底物Rubisco。我们进一步纯化大肠杆菌GroEL/GroES系统，衣藻Cpn60αβ1β2/CrCpn20系统，以及有功能的衣藻异源寡聚体辅分子伴侣素CrCpn23-20-11（包含三种辅分子伴侣素亚基）和拟南芥Cpn20(AtCpn20)，体外研究辅分子伴侣素与分子伴侣素的相互作用特异性。利用非对称场流发现，体外纯化的Cpn20以三聚体的形式存在。与另外三种辅分子伴侣素相似，CrCpn20能够与GroEL相互作用。但CrCpn20不能像其他三种辅分子伴侣素一样抑制GroEL的ATPase活性，也不能与GroEL一起包埋、折叠底物。不过CrCpn20能够与其同系统的Cpn60相互作用并协助其折叠底物，表明作用的特异性。三聚体或者四聚体的Cpn20协助Cpn60折叠底物表明其相互作用是非对称的。为了进一步研究这种非对称相互作用是否在体内存在，我们构建了一系列包含有6-8个类似GroES(10 kD)结构域的串联融合蛋白，相邻结构域由可以自由摆动的三个氨基酸残基(GGG)联接。所有的串联融合蛋白的表现与他们各自的天然状态蛋白一致，如抑制分子伴侣素ATPase活性与折叠底物。表明辅分子伴侣素与分子伴侣素的相互作用有可能是不对称的。体内不同的分子伴侣素和辅分子伴侣素的组合可能折叠特异的底物蛋白。