目的：支气管哮喘(bronchial asthma,简称哮喘)是由多种细胞和细胞组分参与的反复发作的可逆性的气流受限和气道高反应性为特征的气道慢性非特异性炎症性疾病。我国哮喘发病率为1％,其中儿童达3％。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)在炎症反应中起重要作用,是调控神经源性炎症关键的细胞因子,可通过连接神经系统和免疫系统而发挥放大气道炎症的作用。许多研究表明NGF参与哮喘发病,它通过与其高亲和力受体-酪氨酸激酶受体A(tyrosine kinase receptor A,TrkA)及低亲和力受体P75结合在气道炎症、气道高反应性和气道重塑中起重要作用。近年来支气管哮喘与细胞信号传导的研究一直受到国内外学者的普遍关注。越来越多的研究发现哮喘发生不仅仅与免疫炎症相关,同时神经系统也参与了哮喘的发病。但对于他们之间的相互作用及其机制尚不完全清楚。　　 Kinase D-interacting substrate of220kDa(KJdins220),又称作ankyrin repeat-richmembrane spanning protein(ARMS),是一个跨膜支架蛋白,属大蛋白,包含大量的蛋白连接区域,与三种Trk受体和P75受体通过跨膜区域相互作用。ARMS的作用之一是招募蛋白或受体酶作用底物,ARMS作为蛋白激酶D/Kidins220作用底物,是一种新奇的Trk受体酪氨酸激酶下游蛋白。Kidins220经常与Trk和P75共表达形成三元复合物,是唯一的与两种受体相联系的膜蛋白。ARMS在神经细胞正常高表达,这提示神经功能需要一定的ARMS蛋白调节和维持。一系列的衔接蛋白与Trk连接促进细胞内多种信号通路,在这些信号通路中,MAPK持续激活是神经营养信号通路独有的特征。Trk的跨膜区域和ARMS联系。Trk和ARMS的相互作用导致MAP激酶活性增加持续数小时,所以说ARMS作为支架蛋白直接参与和调节神经营养因子信号通路。NGF介导的TrkA通路参与哮喘发病,ARMS参与这条信号通路的调节,那么,ARMS有可能也参与哮喘发病机制,也是哮喘治疗的一个靶点。　　 本研究旨在观察小鼠气道过敏性免疫反应过程中NGF介导的Kidins220信号通路是否被激活。研究NGF及TrkA被阻断后,对Kidins220/ARMS表达的影响;研究Kidins220/ARM被阻断后,对哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性的作用,及对NF-κB表达的影响。有利于进一步阐明NGF介导的参与哮喘发病的信号机制,阐明Kidins220/ARMS信号通路是否参与哮喘发病,为开辟哮喘治疗的新途径提供理论依据。　　 材料和方法：　　 1、实验动物的分组清洁级雌性BALB/c小鼠90只,6-8周龄,体重18-20克,购自中国医学科学院实验动物研究所。按随机数字表法分为5组:(1)PBS对照组(n=18);(2)哮喘模型组(n=18);(3)anti-NGF抗体组(n=18);(4)anti-TrkA抗体组(n=18);(5)anti-ARMS抗体组(n=18)。　　 2、小鼠哮喘模型的制备实验第1天,哮喘组、anti-NGF抗体组、anti-TrkA抗体组、anti-ARMS抗体组小鼠腹腔注射20pg卵蛋白(ovalbumin,OVA)和2mg氢氧化铝混合于0.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)中;实验第8,15,22天,腹腔注射10μgOVA和1mg氢氧化铝混合于0.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)中;实验第23天开始,给予4％OVA(PBS配制)雾化吸入,每天一次,每次25-30分钟至喘息发作,连续7天,anti-NGF抗体组,anti-TrkA抗体组及anti-ARMS抗体组在每次雾化吸入OVA前3小时通过鼻腔分别给予anti-NGF抗体,anti-TrkA抗体及anti-ARMS抗体干预。PBS对照组以PBS代替OVA腹腔注射及雾化吸入,其余均与哮喘组相同。　　 3、气道反应性测定最后一次吸入OVA24小时后开始检测气道反应性。采用梯度浓度的乙酰甲胆碱(methacholine,MCH)激发气道高反应,应用AniRes2005动物肺功能分析系统检测气道阻力(吸气阻力和呼气阻力)。　　 4、支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar larvage fluid,BALF)的检测BALF进行细胞总数计数及分类细胞计数,酶联免疫吸附实验(ELIASA)检测BALF上清中TNF-α、IL-1β、IL-4的表达水平。BALF细胞涂片应用免疫荧光检测kidins220及TrkA的表达。　　 5、苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化各组小鼠肺组织常规固定、石蜡包埋、相同位置切片,HE染色,光镜下观察及图像分析。　　 6、实时荧光定量RT-PCR定量检测实时荧光定量RT-PCR定量检测肺组织中Kidins220 mRNA、IL-1β mRNA、IL-4mRNA、FNF-αmRNA含量及统计学处理。　　 7、免疫印迹(Westem blot)检测Western blot检测肺组织kidins220、NGF、TrkA、CrkL的表达,图像分析及数据处理。　　 8、凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)EMSA检测各组肺组织NFκB结合活性及统计学处理。　　 9、统计学处理所有原始数据采用SPSS15.0软件分析,所有结果均以均数±标准差((-x)+SD)表示,样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)方法,正态分布及方差齐时,两两比较采用LSD检验;非正态分布采用秩和检验;而气道阻力的比较采用多因素方差分析(two-way ANOVA)。P＜0.05为差异有显著性。　　 结果：　　 1、支气管和肺组织病理学观察结果正常对照组小鼠支气管及肺泡结构基本正常,支气管壁无明显炎性细胞浸润。哮喘组小鼠支气管管腔狭窄、管壁增厚,支气管壁内及管周、周围血管及肺泡内可见淋巴细胞及嗜酸粒细胞等炎性细胞浸润,提示小鼠哮喘模型建模成功。Anti-NGF抗体组、anti-TrkA抗体组、anti-ARMS抗体组小鼠支气管和肺组织病理改变程度较哮喘组明显减轻。　　 2、气道反应性测定及分析结果哮喘小鼠对MCH的气道反应性比正常对照组明显增强(P＜0.01),表明小鼠哮喘模型建模成功。而给与anti-NGF抗体、anti-TrkA抗体、anti-ARMS抗体阻断后,气道反应性较哮喘组明显改善。　　 3、BALF细胞总数计数、分类细胞计数及分析结果哮喘组细胞总数及嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞数明显高于正常对照组(P＜0.01),而给与anti-NGF抗体、anti-TrkA抗体、anti-ARMS抗体阻断后,炎症细胞数较哮喘组明显减少(P＜0.01或P＜0.05)。　　 4、实时荧光定量RT-PCR定量检测肺组织中Kidins220 mRNA、IL-1β mRNA、IL-4 mRNA、TNF-α mRNA的表达及分析结果哮喘组Kidins220 mRNA、IL-1β mRNA、IL-4 mRNA、TNF-β mRNA表达量明显高于正常对照组(P＜0.01或P＜0.05),给予anti-ARMS抗体阻断后,IL-1βmRNA、IL-4 mRNA、TNF-αmRNA表达量较哮喘组明显减少(P＜0.01或P＜0.05)。　　 5、免疫荧光检测kidins220、TrkA的表达及分析结果支气管灌沈液细胞涂片做免疫荧光显示,kidins220及TrkA共表达于细胞膜和细胞质,且哮喘组的表达强于正常对照组。　　 6、ELISA检测小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-4表达及分析结果哮喘组小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-4的表达水平较正常对照组明显升高(P＜0.01),而给与anti-NGF抗体、anti-TrkA抗体、anti-ARMS抗体阻断后,TNF-α、IL-1β、IL-4的表达水平较哮喘组明显降低(P＜0.01或P＜0.05)。　　 7、Western blot检测Kidins220、NGF、TrkA、CrkL的表达及分析结果正常对照组肺组织有Kidins220的表达,且哮喘组Kidins220、NGF、TrkA、CrkL的表达明显高于正常对照组(P＜0.01或P＜0.05);而给与anti-NGF抗体、anti-TrkA抗体阻断后,Kidins220、CrkL的表达较哮喘组明显降低(P＜0.01或P＜0.05);给与anti-ARMS抗体阻断后,NGF、TrkA、CrkL的表达较哮喘组明显降低(P＜0.01或P＜0.05)。　　 8、EMSA检测肺组织NFrB结合活性及分析结果哮喘组NFKB结合活性明显高于正常对照组(P＜0.01),给予anti-NGF抗体、anti-TrkA抗体、anti-ARMS抗体阻断后,NFκB结合活性较哮喘组明显减少(P＜0.01)。　　 结论：　　 1、Kidins220在小鼠正常肺组织中有表达,且哮喘组明显高于正常对照组,提示Kidins220可能参与了哮喘的发病。　　 2、Kidins220阻断后可以减轻哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性,提示Kidins220参与哮喘气道炎症和气道高反应性的发生。　　 3、哮喘小鼠Kidins220、NGF、TrkA表达量增加,且Kidins220和TrkA共表达于细胞膜,而采用Kidins220抗体阻断后,NGF、TrkA表达量减少。提示Kidins220可能通过NGF-TrkA途径参与哮喘发病。　　 4、哮喘小鼠NFκB被激活,引起炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-4的过表达;Kidins220阻断后,NFκB结合活性明显降低,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-4的表达也减少。提示Kidins220通过上调NFκB及TNF-α、IL-1β、IL-4的表达参与哮喘气道炎症及气道高反应性的发生。　　 5、哮喘小鼠CrkL表达增加,而采用NGF、TrkA及Kidins220抗体阻断后,CrkL表达量减少。提示CrkL可能是NGF介导的Kidins220途径中的信号分子并参与哮喘发病。