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第一部分1-磷酸鞘胺醇在兔蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中的表达变化及意义目的通过建立“兔枕大池二次注血蛛网膜下腔出血模型”,从动物模型动态观察外周血、脑脊液、脑动脉组织中1-磷酸鞘胺醇在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛发生发展过程中表达量的变化,分析1-磷酸鞘胺醇与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的关系,初步探讨1-磷酸鞘胺醇在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中的作用。方法健康清洁级新西兰纯种大白兔50只(体重2500～2800g),雌雄不限,月龄4-6个月,由三峡大学医学院动物实验中心提供,动物予以标准饲料喂养、自由摄食饮水,22-30℃条件下饲养1周后进行实验。实验大白兔随机分组为:对照组(枕大池注射同等计量生理盐水,未做模型化处理)10只;SAH-1组(SAH后第3天)10只;SAH-2 组(SAH 后第 5 天)10 只;SAH-3 组(SAH 后第 7 天)10 只;SAH-4 组(SAH后第9天)10只。采取通用“兔枕大池二次注血模型”方法造模,具体方法是:30%乌来糖3ml/kg、耳缘静脉麻醉;耳中央动脉取血,首次注血量0.4ml/kg;24小时后二次注血,0.2ml/kg。二次注血后第2天为SAH后第1天。依次类推,采用颅脑TCD评估SAH动物模型情况;实验组造模后分别在第3、5、7、9天将动物麻醉后,取兔耳静脉血后取枕大池脑脊液;各组分别在对应的实验组天数处死大白兔后、立即手术开颅截取全程基底动脉、PBS洗去血管内容物,然后分别留取标本用于病理切片及流式细胞检测。对照组予枕大池注射同等计量的生理盐水,第三天行TCD检测,并完成上述后续步骤。光学显微镜下观察基底动脉的组织形态学情况,采用病理学检查、比较各组基底动脉横断面积的大小;采用流式细胞技术免疫组织化学法检测基底动脉组织中1-磷酸鞘胺醇磷酸酶的表达;采用高效液相色谱法检测各组兔血清及脑脊液中1-磷酸鞘胺醇的浓度。结果1、颅脑TCD结果显示:与正常对照组相比,模型组第3天动物基底动脉流速明显增高,5天左右达到峰值,第7、9天开始下降,但仍高于正常对照组。2、正常对照组大白兔颅内血管走行清晰可见,表面无血凝块形成;实验组大白兔在造模后的第3、5、7、9天均有不同程度的血凝块形成;以第3-5天为重,第9天较前有所好转。3、与正常对照组比较,各组大白兔基底动脉横截面积均有明显的改变。造模后3天基底动脉横截面积明显减少;造模后的第5、7天基底动脉横截面积较第3天有所恢复,但仍显著低于正常对照组。与正常对照组相比,造模后第9天基底动脉横截面积无明显差异,但仍低于正常对照组。4、与正常对照组比较,造模后3天基底动脉1-磷酸鞘胺醇磷酸酶的表达明显增高,5天时可达到高峰,第7天开始下降,但仍显著高于对照组,于第9天时与对照组无统计学差异。5、与正常对照组比较,造模后3天血清1-磷酸鞘胺醇的浓度稍有上升,5天时1-磷酸鞘胺醇浓度明显上升,第7天达到高峰,显著高于对照组,于第9天时下降,仍高于正常对照组。与正常对照组比较,造模后3天脑脊液1-磷酸鞘胺醇的表达明显增高,5天时可达到高峰,第7天开始下降,但仍显著高于对照组,于第9天时仍高于正常对照组。6、将基底动脉组织1-磷酸鞘胺醇磷酸酶与血清及脑脊液中的1-磷酸鞘胺醇浓度之间进行相关性分析,结果表明基底动脉组织中的1-磷酸鞘胺醇磷酸酶变化与血清及脑脊液中1-磷酸鞘胺醇表达变化之间有相关性。结论:1、SAH模型大白兔基底动脉组织中高表达1-磷酸鞘胺醇磷酸酶,高表达的1-磷酸鞘胺醇磷酸酶可促进1-磷酸鞘胺醇的生成。2、SAH模型大白兔血清及脑脊液中存在高浓度的1-磷酸鞘胺醇,其与基底动脉1-磷酸鞘胺醇磷酸酶的浓度及血管横截面积管径的变化相一致,高表达的1-磷酸鞘胺醇可能通过某种途径导致脑血管痉挛。第二部分1-磷酸鞘胺醇在体外模拟缺血缺氧诱导人主动脉平滑肌细胞的表达变化及作用目的:通过体外建立缺血缺氧平滑肌细胞模型,检测缺血缺氧条件下人主动脉平滑肌细胞内鞘氨醇激酶1的蛋白表达水平、mRNA表达水平和1-磷酸鞘胺醇浓度的动态表达变化规律、作用及其与细胞内钙离子浓度的关系,并应用SPHK1二甲基鞘氨醇和慢病毒载体shRNA介导的人鞘氨醇激酶1基因表达沉默两种方式来干预这一过程,试图分析并归纳1-磷酸鞘胺醇与缺血缺氧导致的血管平滑肌细胞收缩之间的关系,然后在此实验研究基础上初步探讨1-磷酸鞘胺醇在平滑肌细胞收缩中的作用机制。方法:将传代培养的T/GHA-VSMC分为正常对照组和缺血缺氧组;采用低氧条件培养人主动脉血管平滑肌细胞来模拟蛛网膜下腔出血所致的缺血缺氧环境(T/G HA-VSMC细胞按常规细胞培养并传代16小时完全贴壁后,更换无血清培养基培养并转移到低氧细胞培养箱内培养24小时。低氧细胞培养箱内的气体组成是93%N2、2%02和5%C02,细胞培养基中氧分压为53mmHg,37℃恒温),24小时后采用QT-PCR检测人鞘氨醇激酶1基因的mRNA表达;Western-blot法检测人鞘氨醇激酶1基因的蛋白表达;ELISA法测定(T/GHA-VSMC)细胞上清液和细胞内1-磷酸鞘氨醇浓度;慢病毒载体shRNA介导的T/G HA-VSMC细胞内鞘氨醇激酶1基因表达沉默;采用钙离子荧光探针Fluo-3/AM检测T/GHA-VSMC细胞内钙离子浓度。结果:1、缺氧诱导人T/GHA-VSMC细胞内鞘氨醇激酶1表达水平上调:正常对照组的人T/G HA-VSMC细胞内SPHK1基因的mRNA和蛋白水平较低;经过24小时低氧条件培养后,缺氧组人T/GHA-VSMC细胞内SPHK1基因的mRNA和蛋白水平均显著上升。2、缺氧诱导人T/GHA-VSMC细胞内1-磷酸鞘胺醇的浓度显著增加:与正常对照组相比,缺氧组T/GHA-VSMC细胞培养液和细胞裂解液中1-磷酸鞘胺醇浓度均有显著升高。3、缺氧诱导人T/GHA-VSMC细胞内Ca离子浓度增加:与正常组细胞相比较,缺氧组细胞内钙离子浓度增加,差异具有统计学意义。4、1-磷酸鞘胺醇上调人T/GHA-VSMC细胞内钙离子浓度:应用SPHK1基因的shRNA干扰慢病毒颗粒感染48小时后,T/GHA-VSMC细胞内SPHK1蛋白表达水平显著下调;而外源性1-磷酸鞘胺醇显著上调T/G HA-VSMC细胞内钙离子浓度;shRNA干扰SPHK1基因表达和SPHK1特异性抑制剂二甲基鞘氨醇均显著抑制了低氧诱导的T/GHA-VSMC细胞内1-磷酸鞘胺醇和钙离子浓度上调。结论:1、缺氧诱导的T/G HA-VSMC细胞中SPHK1高表达上调导致1-磷酸鞘胺醇合成增加。2、低氧诱导的T/GHA-VSMC细胞内1-磷酸鞘胺醇合成增加是细胞内钙离子浓度上调的原因之一,采用siRNA干扰技术沉默SPHK1基因表达和SPHK1特异性抑制剂DMS均显著抑制了低氧诱导的T/G HA-VSMC细胞内1-磷酸鞘胺醇和钙离子浓度上调。第三部分1-磷酸鞘胺醇与颅内动脉瘤破裂所致的自发性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的相关性研究目的:通过分析临床蛛网膜下腔出血患者脑血管痉挛的程度与脑脊液及血浆1-磷酸鞘胺醇水平的关系,进一步验证1-磷酸鞘胺醇与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的相关性。方法:2014年7月至2016年9月我院神经外科收治的、同时满足纳入标准和排除标准的部分动脉瘤破裂所致自发性蛛网膜下腔出血患者共37例。临床Hunt-Hess分级Ⅰ～Ⅲ级,其中27例(男16例,女11例,平均年龄61.25±8.92岁)行DSA检查证实中至少有1-2个分段血管痉挛,将其纳入血管痉挛组;另有10例(其中男6例,女4例,平均年龄63.17±9.76岁)DSA检查未发现脑血管痉挛,纳入无血管痉挛组。同时,按相同纳入及排除标准,选取同时期住院、无颅内出血、且行DSA检查未见血管痉挛及血管狭窄的患者12例(男7例,女5例,平均年龄62.49±10.27岁)纳入对照组。痉挛组及无痉挛组患者经头颅CT或腰穿证实为蛛网膜下腔出血;痉挛组及无痉挛组患者入院24小时内行DSA检查确诊颅内动脉瘤,并同时成功行颅内动脉瘤介入栓塞治疗;对照组经头颅CT或腰穿证实无蛛网膜下腔出血,且DSA检查未见血管痉挛及血管狭窄。分别在发病后第3、5、7、10、14天行TCD检测跟踪血管痉挛程度。采用高效液相色谱法测定血浆及脑脊液1-磷酸鞘胺醇水平。结果:1、与无痉挛组和正常对照组相比,痉挛组大脑中动脉流速在第3天已明显升高,第5天呈进行性升高趋势,第7天达到峰值,第10天呈下降趋势,第14天恢复正常。2、与无痉挛组和正常对照组相比,痉挛组发病后3天患者血清1-磷酸鞘胺醇的浓度升高,第5天达到高峰,第7-10天时下降,但仍高于正常对照组,第14天时降至无明显差异。3、与无痉挛组和正常对照组相比,痉挛组发病后3天患者脑脊液1-磷酸鞘胺醇的浓度升高,5天时明显升高,第7天达到高峰,显著高于对照组,第14天时降至无明显差异。4、将大脑中动脉血流速度与血清及脑脊液中的S1P浓度之间进行相关性分析,结果表明大脑中动脉血流速度与血清及脑脊液中S1P表达变化之间有相关性。