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本论文在基于水溶性共轭聚合物的疾病相关生物大分子的传感研究领域开展了以下几个方面的工作:
1.通过调控阴离子共轭聚合物荧光猝灭一恢复的可逆过程,实现了乙酰胆碱酯酶(AChE)的高灵敏检测以及酶抑制剂的筛选。荧光猝灭基团dabcyl修饰的阳离子乙酰胆碱(ACh-dabcyl)通过静电相互作用与阴离子聚芴形成复合物,导致聚合物荧光高效猝灭。AChE催化ACh-dabcyl水解,dabcyl基团发生电荷反转而远离复合物,能量转移过程中断,聚合物荧光恢复。通过监测聚合物荧光信号变化,实现了对AChE活性定量、实时地检测,测定了酶动力学参数。通过酶抑制实验测定了酶抑制剂的IC50值,为阿尔茨海默氏症(AD)的治疗提供了一个快速药物筛选的新方法。
2.发展了基于水溶性共轭聚合物的酶联反应荧光检测方法。利用阳离子酚类化合物与阴离子聚芴形成的静电复合物,以荧光“tum-off”的方式实时检测了酪氨酸酶的活性。在氧气存在下,酪氨酸酶催化氧化酚类底物产生醌,醌通过电子转移过程高效猝灭聚合物的荧光,从而实现对酪氨酸酶的灵敏检测。该方法可用于酪氨酸酶抑制剂筛选,并可扩展到其他酶促反应检测。将上述阳离子酚与半乳糖共价连接,作为β-半乳糖苷酶的底物,与阴离子聚芴形成静电复合物,通过酪氨酸酶偶联反应,成功实现了β-半乳糖苷酶活性的实时检测。本方法不但避免了对酶底物分子的荧光标记,而且高效荧光猝灭效应极大地提高了检测灵敏度。
3.制备了荧光素标记的DNA(DNA-FI)与阳离子聚芴的静电复合物,通过测定聚芴和荧光素之间的荧光共振能量转移(FRET)信号,实现了对限制性及非限制性核酸内切酶的灵敏检测。其中核酸酶S1的检测限(LOD)非常低,与目前报道的最灵敏的检测方法处于同一数量级。根据甲基化的DNA抑制限制性内切酶活性的原理,利用DNA-F1与阳离子聚芴的静电复合物,成功实现了对DNA甲基化转移酶活性的灵敏分析。
4.发展了一种方便、灵敏、免标记引物的DNA甲基化检测新方法。结合单碱基延伸反应(SBE)的高特异性和共轭聚合物的光学信号放大性能,高灵敏检测了质粒和人直结肠癌细胞的特异CpG位点的甲基化状态。当引物探针与bisufite-PCR产物序列匹配时,SBE反应中荧光素修饰的dGTP(dGTP-FI)被扩增到引物DNA探针的3’-末端,与阳离子聚物发生有效的能量转移。方法可以检测到质粒的1%甲基化。另外该新方法避免荧光染料分子共价标记目标DNA或引物DNA,从而简化操作步骤、提高实验的重复性。这些优点使检测体系有望用于早期癌症诊断。
5.以阳离子聚芴为探针,结合FRET技术,发展了一种新型、简便的具有基因特异性的DNA甲基化检测方法。dNTPs中掺入少量荧光素标记的dGTP和dUTP,在巢式MSP(甲基化特异性的PCR)扩增反应中荧光素标记的dGTP和dUTP被扩增到生成的DNA分子上,dNTPs降解后,不需分离步骤,加入阳离子聚芴以及灵敏地检测DNA分子,从而实现基因特异性的DNA甲基化检测。作者分析了五种肿瘤细胞的三个基因启动子的甲基化状态,发现p16、HPPI和GALR2三种基因可作为直结肠癌的候选标志物。该方法灵敏度高、成本低、简单设备即可满足要求,这些优点使检测体系有望用于早期癌症诊断和预后跟踪。
6.发展了一种基于阳离子聚芴的DNA光损伤的光学检测方法。含有相邻胸腺嘧啶碱基(-TT-二核苷酸)的DNA经过紫外辐照形成-TT-二联体,阻碍引物延伸反应,荧光素标记的碱基不能被扩增到引物3’-末端,与阳离子聚芴作用时不能发生有效的FRET;而以未经紫外辐照的DNA为模板,可以发生引物延伸反应,阳离子聚芴与荧光素之间的FRET效率较高。因此,根据FRET信号的变化,可以检测特异位点的DNA光损伤。这个方法提供了一种在水溶液中方便检测DNA光损伤的方法,无需分离和洗涤步骤。