【摘 要】
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背景蛋白质泛素化是一种动态的多层次翻译后修饰,涉及真核生物的多种生物学功能。例如,基因转录,DNA修复,信号转导,自噬和细胞周期调控等。目前也有数据表明,泛素化修饰通过靶向关键蛋白在信号转导途径中的活性,稳定性,亲和力和位置,在宿主抗病毒固有免疫应答中发挥重要的功能。而病毒诱导的信号接头蛋白（Virusinduced signaling adaptor,VISA）是RIG-I样受体（RIG-I l
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背景蛋白质泛素化是一种动态的多层次翻译后修饰,涉及真核生物的多种生物学功能。例如,基因转录,DNA修复,信号转导,自噬和细胞周期调控等。目前也有数据表明,泛素化修饰通过靶向关键蛋白在信号转导途径中的活性,稳定性,亲和力和位置,在宿主抗病毒固有免疫应答中发挥重要的功能。而病毒诱导的信号接头蛋白（Virusinduced signaling adaptor,VISA）是RIG-I样受体（RIG-I like receptors,RLRs）介导的先天免疫应答中的关键接头蛋白,对于VISA的泛素化修饰的精密调控可以确保先天抗病毒反应的最佳激活和及时终止。我们发现RNF90是修饰蛋白家族的E3泛素连接酶,通过靶向干扰素基因刺激因子（Stimulator of interferon genes,STING）的降解负向调控DNA病毒诱导的固有免疫应答。然而RNF90在RNA病毒诱导的VISA介导的抗病毒信号通路调控机制中尚不清楚。目的揭示RNF90在抗病毒固有免疫反应中的功能,以RNF90与VISA的相互作用为切入点,阐明RNF90对于VISA介导的抗病毒信号通路中的调控作用及具体机制,为临床治疗中对于抗病毒药物的研制提供一种新思路。方法1.检测RNF90在胞质RNA诱导的固有免疫应答中的功能。首先,在细胞系中确定RNF90的功能。在细胞中过表达RNF90或转染针对RNF90的si RNA后,水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus,VSV）或poly（I:C）刺激细胞特定时间,通过免疫印迹,Real-time,标准病毒空斑等实验来确定RNF90的功能。在原代细胞中进一步验证其功能。2.研究RNF90在体内RNA病毒诱导的固有免疫应答中的功能。构建RNF90缺陷小鼠模型,在WT与RNF90敲除小鼠中腹腔注射VSV,通过病理切片,ELISA,Real-time,每天观察小鼠的生存情况等进一步确定RNF90在抗病毒固有免疫中的功能。3.确定RNF90的靶分子及其发挥功能的机制。确定RNF90的靶分子。通过外源性及内源性co-IP实验验证两者是否有相互作用;荧光共聚焦实验验证RNF90和VISA是否有共定位;将RNF90的截断体与VISA或RNF90与VISA的截断体进行共转,确定相互作用的具体结构域。确定RNF90发挥功能的机制。将VISA与RNF90,HA-ubi及相互突变体进行共转染,通过免疫印迹及免疫沉淀来验证RNF90是否影响VISA的稳定性及泛素化水平。结果RNA病毒及poly（I:C）刺激细胞后可以诱导RNF90的表达;RNF90的过表达能够抑制由poly（I:C）转染或者VSV感染诱导的固有免疫反应;RNF90沉默明显的促进poly（I:C）转染或者VSV感染诱导的固有免疫反应并且抑制VSV病毒的复制;在RNF90缺失的MEF中得到了一致的结论;与WT小鼠相比,RNF90缺陷可以延长小鼠生存时间,肺部组织损伤较小,具有更强的抗病毒能力;RNF90与VISA具有相互作用;RNF90促进VISA的降解;RNF90促进VISA的K48连接的泛素化。结论RNF90和VISA相互作用,增加其K48连接的泛素化,从而降低VISA的稳定性,对抗病毒免疫反应发挥负向调控的作用。
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