目的： ADAMTS9及RNF180是新发现的两种抑癌基因，其中ADAMTS9主要通过抑制血管形成来抑制肿瘤的生长，RNF180通过调节靶蛋白底物的泛素化而在细胞生长及发育过程中发挥作用。既往人们已在其他肿瘤组织中检测到这两个基因的异常甲基化，之前我们也已在肝癌组织中研究了这两个基因的甲基化状态，发现这两个基因在肝癌组织中的甲基化率明显高于肝硬化及正常组织，表明这两个基因的甲基化状态可能参与了肝癌的发生发展，并且这两个基因的甲基化状态对肝癌患者的病情评估及预后判断也具有一定的价值。但基于组织标本的研究创伤性较大且获取困难，不适宜用于肿瘤的筛查及早期检测，相较而言血浆及血清标本则比较容易获得，且创伤性小。既往已有研究证明肿瘤组织与配对血浆或血清样本中DNA甲基化的改变具有一致性,表明血浆中DNA甲基化状态有望成为一种新的肿瘤标记物。因此，本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR，MSP)的检测方法，对肝癌、肝硬化及健康人的血浆标本DNA进行抑癌基因ADAMTS9，RNF180启动子区域的甲基化检测，研究其对肝癌的诊断价值，并分析其与临床资料及生存期预后的关系，筛选出对肝癌的发生发展、临床诊断及预后判断具有重要价值的新的血清学标志物。方法：1研究对象：2009年4月至2011年9月于河北医科大学第四医院消化内科住院的肝癌患者90例，肝硬化患者65例及健康人80例。90例肝癌患者血浆标本收集前均未做任何治疗，包括手术、化疗及介入治疗。90例肝癌患者中男性72例，女性18例，年龄为33~77岁，平均年龄为(56.41±10.76)岁，65例肝硬化患者中，男性患者45例，女性患者20例，年龄在23~78岁，平均年龄为(58.82±9.85)岁。依据巴塞罗那临床肝癌(Barcelona clinic liver cancer,BCLC)分期对90例肝癌患者进行临床分期，其中A期、B期、C期、D期的例数分别为27例、16例、33例和14例。收集所有患者病史、实验室检查结果等临床资料，通过电话联系的方式对肝癌患者进行随访，并计算其生存时间。2抑癌基因启动子区域的甲基化检测方法：将经EDTA抗凝的全血(约2ml)经2500rpm离心2分钟后取上清液得到血浆标本，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取血浆DNA，用BisulFlash DNA Modification Kit甲基化试剂盒进行血浆DNA甲基化修饰及纯化，具体步骤按试剂盒说明书进行，采用甲基化特异性PCR的方法检测血浆中ADAMTS9及RNF180基因DNA甲基化状态。PCR扩增引物的序列分别是：ADAMTS9基因甲基化的引物序列为:上游引物5’-ttgttcgttcgttgggtattatgcg-3’,下游引物5’-ccaacttttaactttaaaaatcgct-3’,非甲基化的引物序列为:上游引物5’-tgtttgtttgttgggtattatgtgg-3’,下游引物5’-ccaacttttaactttaaaaatcact-3’;RNF180基因甲基化的引物序列为:上游引物5’-gacgtggggcgagtagggtcgtt-3’，下游引物5’-ccgaccgaaaccaaatccctccgaa-3’，非甲基化的引物序列为:上游引物:5’-gatgtggggtgagtagggttgtt-3’,下游引物5’-ccaaccaaaaccaaatccctccaaa-3’。对抑癌基因ADAMTS9、RNF180进行目的片段的扩增，扩增产物通过电泳凝胶成像系统进行甲基化结果分析判定。3统计学分析：所有数据均使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，以P＜0.05认为有统计学意义。结果：1肝癌、肝硬化及健康人血浆中ADAMTS9、RNF180基因甲基化状态及比较ADAMTS9基因启动子区甲基化阳性率在肝癌和肝硬化血浆中分别为15.56%(14/90)和3.08%(2/65)，健康人血浆中未发现甲基化0%(0/80)，三组的甲基化阳性率的差异有统计学意义(χ2=18.124，P=0.000<0.05)。对肝癌组及肝硬化组血浆DNA甲基化进行比较，差异有统计学意义(χ2=6.349，P=0.012<0.05)。健康人组与肝癌组血浆DNA甲基化进行比较，差异有统计学意义(χ2=13.561，P=0.000<0.05)。健康人组与肝硬化组血浆DNA甲基化进行比较，差异无统计学意义(P=0.199>0.05)。RNF180基因启动子区甲基化阳性率在肝癌和肝硬化血浆中分别为6.67%(6/90)和4.62%(3/65)，健康人血浆中未发现甲基化0%(0/80)，三组的甲基化阳性率的差异无统计学意义(χ2=5.261，P=0.072>0.05)。对肝癌组及肝硬化组血浆DNA甲基化进行比较，差异无统计学意义(χ2=0.036，P=0.849>0.05)。健康人组分别与肝癌组及肝硬化组血浆DNA甲基化进行比较，差异均无统计学意义(P=0.053，P=0.175)。2肝癌血浆中ADAMTS9，RNF180基因甲基化状态与临床资料的比较90例肝癌患者血浆中ADAMTS9，RNF180基因甲基化状态与患者的年龄、性别、Child-pugh分级、AFP值大小、肿瘤个数、HBsAg是否阳性、BCLC分期及是否伴有肝硬化、有无门静脉瘤栓、是否伴有转移均无关，各组的差异均无统计学意义(P>0.05)。以AFP≥400ug/L为阳性标准，AFP<400ug/L认为AFP检测阴性。90例肝癌患者中AFP检测阳性的例数为39例，占43.33%，在剩余的51例AFP阴性病例中9例发生了ADAMTS9基因启动子区甲基化，占17.65%，4例发生了RNF180基因启动子区域甲基化，占7.84%。联合检测血浆ADAMTS9和RNF180基因甲基化阳性率为18.89%(17/90)，两种基因甲基化状态检测联合AFP检测的肝癌检出率为55.56%(50/90)。3血浆ADAMTS9，RNF180基因甲基化检测对肝癌的诊断价值在肝癌、肝硬化及健康人三组共235例血浆标本中，ADAMTS9基因甲基化对肝癌检测的灵敏度为15.6%，特异度为98.6%；RNF180基因甲基化对肝癌检测的灵敏度为6.7%，特异度为97.9%；联合ADAMTS9及RNF180基因甲基化检测对肝癌检测的灵敏度为18.9%，特异度为96.6%。4肝癌血浆ADAMTS9，RNF180基因甲基化状态与生存期预后的关系及肝癌预后因素分析ADAMTS9基因甲基化阳性患者的平均生存时间为(23.714±6.576)个月；ADAMTS9基因甲基化阴性患者的平均生存时间为(16.054±2.028)个月。两组生存率比较，差异无统计学意义(P=0.321>0.05)。RNF180基因甲基化阳性患者的平均生存时间为(23.000±10.518)个月；RNF180基因甲基化阴性患者的平均生存时间为(16.715±2.006)个月。两组生存率比较，差异无统计学意义(P=0.653>0.05)。对肝癌患者的年龄、性别、Child-pugh分级、AFP值、肿瘤数目、HBsAg是否阳性、有无门静脉瘤栓、肝癌BCLC分期共8个因素进行Log-Rank单因素分析，发现门静脉瘤栓的有无及child-pugh分级对肝癌患者的生存率有影响，其差异具有统计学意义，(P=0.020，P=0.040)。进一步COX多因素分析结果提示，Child-pugh分级及门静脉瘤栓有无为肝癌生存期预后的独立预后因子(P=0.024<0.05，P=0.006<0.05)，其他9项因素均不能作为肝癌生存期预后的独立预后因子。结论：1肝癌患者血浆中ADAMTS9基因甲基化阳性率显著高于肝硬化组和健康对照组，提示ADAMTS9基因甲基化在肝癌的发生发展中可能起一定作用。2检测血浆中ADAMTS9及RNF180基因的甲基化状态对于肝癌诊断的特异度高，但敏感性低，二者甲基化检测联合AFP检测对于肝癌诊断的敏感性提高仍不明显，表明该检测指标不适宜作为肝癌诊断的标志物，也不适宜用于高危人群的筛查。3血浆中抑癌基因ADAMTS9和RNF180甲基化状态不能作为肝癌患者病情评价及预后判断的指标。Child-pugh分级及门静脉瘤栓有无可以作为评价肝癌生存期预后的独立预后因子。