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目的:在前期工作研究中,我们通过临床病理研究发现,Krüppel样因子4(KLF4)在食管鳞癌中呈低表达,而在正常食管粘膜中呈高表达,其表达与食管鳞癌的分期及患者的预后密切相关。另外,通过甲基化特异性PCR、Western blot检测食管鳞癌细胞系:CAES17、EC109、KYSE-140、KYSE-70和KYSE-30中KLF4相对高表达,TE1和KYSE-510中KLF4相对低表达。结果发现,KLF4在KYSE140细胞系中呈低甲基化高表达,而在TE1中呈高甲基化低表达。本课题主要是通过体外细胞学实验,进一步研究KLF4在食管鳞癌细胞中的表达及其作用,并探讨其对PI3K/AKT信号通路的影响。目的是初步探讨KLF4在食管鳞癌发生、发展中的作用及其机制,为今后以KLF4为靶基因的食管鳞癌的基因治疗提供依据。方法:1、构建以慢病毒为载体的靶向KLF4 RNA干扰(LV-shKLF4-A~C)的表达载体,通过荧光、RT-PCR、Western blot筛选出干扰效率最高的一组(选择最佳干扰序列)。构建以慢病毒为载体的包含KLF4全长表达(LV-KLF4)载体,转染并筛选出稳定传代的食管癌细胞系。通过测序、荧光、RT-PCR、Western blot法验证慢病毒载体是否构建成功。2、将LV-sh KLF4-C及LV-KLF4分别转染对数生长期的KYSE140细胞系和TE1细胞系,通过Western blot检测KYSE140细胞RNA干扰前后KLF4蛋白的表达水平及TE1细胞过表达前后KLF4蛋白的表达水平;通过划痕实验检测KYSE140细胞RNA干扰前后的迁移能力及TE1细胞过表达前后的迁移能力;通过Transwell实验检测KYSE140细胞RNA干扰前后的侵袭能力及TE1细胞过表达前后的侵袭能力;MTT实验检测检测KYSE140细胞RNA干扰前后的增殖能力及TE1细胞过表达前后的的增殖能力。3、通过Western blot检测检测KYSE140细胞RNA干扰前后的P-AKT、AKT蛋白的表达水平及TE1细胞过表达前后的P-AKT、AKT蛋白的表达水平。结果:1、以慢病毒为载体的靶向KLF4 RNA干扰(LV-sh KLF4-C)及包含KLF4全长表达载体(LV-KLF4)构建成功,其中LV-sh KLF4-C组的干扰效率最高。2、Western blot检测LV-sh KLF4-C组中KLF4的蛋白表达水平较空白对照组、空载对照组降低,LV-KLF4组中KLF4的蛋白表达水平较空白对照组、空载对照组升高;划痕实验结果显示,LV-sh KLF4-C组的迁移能力较空白对照组、空载对照组升高,LV-KLF4组的迁移能力较空白对照组、空载对照组降低;通过Transwell实验结果显示,LV-sh KLF4-C组的侵袭能力较空白对照组、空载对照组升高;LV-KLF4组中的侵袭能力较空白对照组、空载对照降低;通过MTT实验结果显示,LV-sh KLF4-C组的增殖能力较空白对照组、空载对照组升高,LV-KLF4组的增殖能力较空白对照组、空载对照组降低。空白对照组与空载对照组之间差异均无统计学差异。实验结果显示:KLF4蛋白的表达与食管鳞癌细胞的迁移、侵袭、增殖能力呈负相关。3、Western blot检测:LV-sh KLF4-C组中P-AKT的蛋白表达水平较空白对照组、空载对照组升高;LV-KLF4组中P-AKT的蛋白表达水平较空白对照组、空载对照组降低,AKT表达均无统计学差异。结论:1、成功构建了以慢病毒为载体的靶向KLF4 RNA干扰(LV-shKLF4-A~C)及包含KLF4全长表达(LV-KLF4)的过表达慢病毒载体。2、KLF4对食管癌细胞系的迁移、侵袭、增殖有一定的影响,在食管鳞癌细胞中,起抑癌作用。3、食管鳞癌细胞系中,KLF4的表达可影响PI3K/Akt信号通路。