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泡沫病毒(Fomay virus,FV)属在分类上归于反转录病毒科泡沫病毒亚科,它们能在多种动物中产生持续性感染。但至今没有其引发疾病的报道。该属病毒具有复杂的基因组结构和独特的基因表达调节过程,与传统的反转录病毒区别较大。它的基因转录受到两个启动子的调节,其中位于5’端的LTR(longterminal repest)负责结构基因的转录,位于env基因内部的启动子IP(internalpromoter)则调节反式激活因子(transactivator of spmavirus,Tas)等非结构蛋白的合成。Tas蛋白作为病毒的反式激活因子,可以通过直接结合在这两个启动子上激活下游基因表达。Bet则是存在于病毒复制过程中,受IP调节的另一个非结构蛋白。本室主要研究牛的泡沫病毒(bovine fomay virus,BFV),本文即是对BFV Bet蛋白在病毒复制过程中的功能及其作用机制进行深入的研究。
在本文中,发现Bet蛋白可以抑制BFV的复制,并对其作用的主要机制进行了研究探讨。主要获得了以下几个层面的结果:
1)报告系统层次,利用荧光素酶报告系统,证明了Bet可以抑制BTas对病毒LTR和IP两个启动子的激活,并且证明这种抑制呈剂量依赖性。
2)分子机制层次,本文对Bet抑制BTas反式激活LTR的机制进行了研究,通过GST-pull down和CO—IP实验证明了BTas和Bet有直接的相互作用,并且利用凝胶迁移率阻滞实验(electrophoreticmobility shift assay,EMSA)证明了Bet和BTas都同LTR有直接的相互作用,且Bet通过结合在LTR上行使抑制功能。
3)作用精确序列确定,找出了和Bet抑制BTas反式激活的两段DNA序列,并发现这两段DINA序列在抑制作用中起不同的作用。其中LTR(613—635)同时被BTas和Bet结合,Bet通过和BTas竞争而起到抑制作用,LTR(635—654)只被Bet结合,它通过空间位阻的方式影响BTas在LTR(613—635)和LTR(654—674)的结合并最终影响了后者对LTR的反式激活作用。
4)细胞水平,虽然本文发现并探索了Bet抑制BTas反式激活LTR的机制,但没能在细胞水平检测出Bet对病毒复制的抑制。