【研究背景及目的】迄今为止,肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)仍然是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发生率和死亡率均位居所有恶性肿瘤前列。由于存在大量乙肝病毒感染者,我国是肝癌高发区,每年约有11万人死于该病。目前,肝癌的治疗强调手术、介入治疗、化疗、生物治疗等综合治疗。而手术治疗仍然是肝癌综合治疗中最重要的一环,其对改善肝癌患者预后至关重要,但是肝癌的局部及远处转移严重影响手术患者预后,大大降低了肝癌患者的生存时间。而对于肝癌的转移,目前尚缺乏有效药物进行预防和治疗,因此目前肝癌的五年生存率依然很低。肝癌的转移过程涉及到多种基因及细胞信号通的参与。目前研究认为,上皮-间质转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)是肝癌转移发生中的重要事件,在肝癌转移中起着重要的促进作用。已有研究发现多种信号通路参与EMT过程,比如PI3-K/Akt,Wnt,Notch,Hedgehogand nuclear factor-kappaB等,但肝癌转移的分子机制尚未完全完全阐明。肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factors,HNFs)家族对肝脏的分化、发育以及成熟肝细胞正常功能的维持起着决定性的作用。我们前期研究表明,HNF4α和HNF1α均可诱导肝癌细胞向正常肝细胞分化,并显著抑制肝脏种植瘤的生长。晚近,Hatziapostolou M等发现肝细胞中一过性的下调HNF4α可以通过激发miRNA调节环路诱发肝细胞的恶性转化过程。小鼠成熟肝细胞中敲除HNF4α可以促进肝癌的发生。这些研究结果都说明HNFs作为肝脏分化调控因子在肝癌的发生发展过程中同样起着核心作用。转录因子FOXA(又被称为HNF3)包括FOXA1(HNF3α),FOXA2(HNF3β)和FOXA3(HNF3γ),因其含有翼螺旋/叉头DNA结合区而得名。既往研究表明FOXA2在肺癌、乳腺癌、甲状腺癌等多种肿瘤组织中表达明显下调。晚近研究发现,IKK-α介导的FOXA2磷酸化失活对肝脏炎-癌演变起至关重要的作用,且Foxa1和Foxa2对于肝癌发生的性别差异也起着决定性作用。但FOXA2在肝癌转移过程中的作用尚无报道。基于FOXA2在肝细胞分化、肝脏发育中的重要地位以及在HCC发生中的重-2-要作用,在本研究中我们检测肝癌组织、癌旁组织中foxa2的表达差异,比较不同肝肿瘤细胞株中foxa2表达量及其与细胞迁移能力的关系,利用慢病毒体外感染肝肿瘤细胞株,通过上调foxa2及下调foxa2表达检测其对肝肿瘤细胞株细胞迁移、侵袭以及在小鼠体内转移能力的影响。并进一步阐述foxa2抑制肝癌细胞转移的分子机制,为临床预防和治疗肝癌转移提供新的靶点和工具。【实验方法】一、检测foxa2在原发性肝癌发生发展过程中变化情况1.利用real-timert-pcr及westernblot方法检测72例人肝癌组织(标记为“n”)、癌旁组织(标记为“t”)和肝脏门静脉癌栓组织(标记为“p”)中foxa2表达量差异。2.根据有无血运转移将72对人肝癌组织标本按进行分组(有转移组命名为hcc-vi组,相反则为hcc组),比较两组间foxa2表达量差异。3.分析肝癌患者肝癌组织中foxa2表达量与血管侵犯、包膜完整度、肿瘤分化程度、tnm分期、单反/多发病灶间等病理特征的关系。二、制备过表达foxa2及其低表达慢病毒载体1.foxa2过表达载体表达foxa2慢病毒载体psin-ef1α-foxa2及对照病毒psin-ef1α-gfp在前期实验中已由本实验室成功构建。2.foxa2低表达载体小干扰foxa2慢病毒载体系统由骨架质粒plko.1及包装质粒pmd2.g及pspax2三质粒组成,均购自addgene。人工合成含有shfoxa2转录模板以及互补序列的单链dna片段,重组后获得质粒plko.1-shfoxa2。将plko.1-shfoxa2骨架质粒及包装质粒pspax2、pmd2.g通过转染293t细胞获得慢病毒lenti-shfoxa2。以相同方法获得对照病毒lenti-shnc。三、检测foxa2对肝癌细胞株emt的影响1.利用real-timert-pcr及westernblot方法检测不同肝癌细胞株中foxa2表达量与emt标志基因e-caherin及vimentin表达量的关系。2.利用过表达慢病毒psin-ef1α-foxa2感染肝癌细胞株focus,上调其中foxa2表达,检测肝癌细胞形态学变化及e-cadherin、vimentin表达量变化情况;利用小干扰慢病毒plko.1-shfoxa2感染肝癌细胞株hepg2,下调细胞株中foxa2表达,同样方法观察细胞形态变化及e-cadherin、vimentin表达量变化情况。四、观察foxa2变化对肝癌细胞株迁移及侵袭能力的影响1.利用real-timepcr、westernblot、transwell方法检测不同肝癌细胞株中foxa2表达量及其与细胞迁移能力的关系。2.分别利用过表达、低表达慢病毒载体,观察foxa2表达变化对肝癌细胞迁移、侵袭能力的作用。五、观察foxa2对肝癌细胞体内转移的影响1.构建表达荧光素酶(luciferase,luc)慢病毒骨架质粒psin-ef1α-luc,并使用相同方法包装得到慢病毒lenti-luc,该病毒具有嘌呤霉素抗性。2.利用lenti-luc感染focus细胞后经嘌呤霉素筛选、挑单克隆培养及荧光素酶表达验证建立高效表达luc稳转细胞株focus-luc。3.将lenti-foxa2或lenti-gfp感染的focus-luc细胞以2×105/只种植于免疫缺陷小鼠(nod/scid)腋窝皮下,每周使用游标卡尺测量皮下成瘤大小,同时使用活体成像观察远处器官转移情况。4.focus-luc细胞株分别感染慢病毒lenti-foxa2或对照病毒lenti-gfp后,以2×105/只经尾静脉注入免疫缺陷小鼠(nod/scid)体内,经注射荧光素酶底物后利用活体成像仪器观察肿瘤细胞在小鼠体内不同器官的转移灶情况。六、探讨foxa2抑制肝癌转移的分子机制1.利用real-timepcr及westernblot方法检测在肝癌细胞中上调foxa2及下调foxa2表达对mmp9表达的影响。2.利用jaspar[1]数据库预测foxa2在mmp9启动子附近潜在的结合位点,分别构建包含不同结合位点的报告基因质粒,转染入过表达lenti-foxa2或lenti-gfp的focus细胞株,通过检测荧光素酶表达水平预测foxa2在mmp9基因上的结合位点,并使用chip方法明确该结合位点。3.肝癌细胞株hepg2分别转染nc、foxa2sirna、mmp9sirna、foxa2sirna+mmp9sirna,检测上述不同处理对细胞迁移能力的影响;利用real-timert-pcr、westernblot方法检测小鼠体皮下成瘤组织及人肝癌组织中foxa2、mmp9表达量,并分析两者的关系。-4-七、统计学分析数据采用spss18.0统计软件包进行分析,结果以mean±sd表示。两组间数据若方差齐性则采用t检验,若为方差非齐性数据则采用非参数检验,多组间采用one-wayanova分析,计数资料使用χ2检验,非成对t检验,方差非齐性则采用非参数检验;p<0.05可认为差异有显著性,p<0.01可认为差异有非常显著性。【实验结果】一、foxa2表达量与肝癌发生发展呈负相关1.real-timepcr结果显示,在72例肝癌标本中,68.1%(49/72)的肝癌组织较癌旁组织foxa2表达量明显下降;hcc-vi组肝癌组织中foxa2表达量较hcc组明显下降(p<0.001)。2.对4例伴有门脉癌栓的肝癌标本进行分析,结果显示门静脉癌栓组织中foxa2表达量较肝癌组织进一步下降。3.对72例肝癌患者的临床资料与foxa2表达水平进行分析,结果表明人肝癌组织中foxa2表达量与血管侵犯、分化程度、tnm分期均呈负相关(p=0.046,p=0.004,p=0.004),而与患者年龄、性别、肿瘤大小、afp、hbsag、癌结节数量、包膜侵犯均无显著相关性(p>0.05)。二、成功构建小干扰foxa2慢病毒lenti-shfoxa2及对照病毒lenti-shnc空载慢病毒骨架质粒plko.1经ecori及agei酶切后分别与含有编码shfoxa2及shnc的双链dna片段连接得到小干扰慢病毒骨架质粒plko.1-shfoxa2及对照病毒骨架质粒plko.1-shnc,两者分别与包装质粒pmd2.g、pspax2共转染入293t细胞中,收取含有病毒颗粒的培养液上清,离心、过滤后分别得到小干扰foxa2慢病毒lenti-foxa2及对照病毒lenti-shnc。三、foxa2抑制肝癌细胞emt1.在肝癌细胞株huh7、hepg2、mhcc97l、mhcc97h、mhcclm3、focus中,foxa2表达量与上皮细胞标志基因e-caherin表达量呈正相关,与间质细胞标志基因vimentin表达量呈负相关。2.在focus细胞中过表达foxa2后,细胞形态发生明显变化,细胞梭形触角消失,由长条状变为浑圆状,e-cadherin表达明显上升,vimentin表达下降;在hepg2细胞中小干扰foxa2后,细胞形态由浑圆变得细长,出现梭形触角,e-cadherin表达下降,vimentin表达量明显上升。四、foxa2显著影响肝癌细胞的迁移及侵袭1.foxa2表达量与肝癌细胞株huh7、hepg2、mhcc97l、mhcc97h、mhcclm3、focus的迁移能力成负相关。2.利用慢病毒载体上调及下调foxa2表达后,transwell方法检测结果显示foxa2显著抑制肝癌细胞的侵袭、迁移能力。五、foxa2抑制肝癌细胞体内转移1.为获得表达荧光素酶基因的稳转肝癌细胞株,构建表达luciferase的慢病毒骨架质粒psin-ef1α-luc,并与pmd2.g、pspax2共转染入293t细胞,得到慢病毒lenti-luc。经感染慢病毒lenti-luc、嘌呤霉素筛选、挑单克隆、荧光素酶表达验证成功得到稳定、高效表达荧光素酶基因的细胞株focus-luc。2.在皮下种植瘤肝癌转移模型中,过表达foxa2的肝癌细胞在皮下成瘤的体积、重量没有统计学差异(2.36±2.40cm3vs.3.90±2.52cm3,p=0.403),但其在小鼠骨组织、脑组织中形成的转移灶明显减少,gfp组的骨转移和脑转移分别为100%(5/5)、20%(1/5),而foxa2处理组相应的转移率为20%(1/5)、0%(0/5)。4.尾静脉注射肝癌转移模型结果显示,foxa2显著抑制肝癌细胞株的肺转移:gfp组的肺转移率为60%(3/5),foxa2处理组没有发生肺转移(0/5)。六、foxa2部分通过转录水平抑制mmp9表达抑制肝癌转移1.在focus细胞中过表达foxa2后,mmp9表达量明显下降;在hepg2细胞中小干扰foxa2后,mmp9表达量明显上升。2.使用jaspar数据库对mmp9基因启动子-1000bp至3000bp区域进行分析,预测到转录因子foxa2潜在结合位点6个,使用报告基因pgl3-promoter进行定位分析得出:foxa2可结合于启动子下游511-988bp区域,而此区域位于mmp9基因第一个内含子上;进一步的chip实验进一步证实foxa2可直接结合于此区域。3.干扰foxa2表达后可使hepg2细胞的迁移能力升高,而同时干扰mmp9表达可减弱此作用;与对照组相比,过表达foxa2后的focus细胞成瘤组织中,mmp9表达量明显下降;在72例人肝癌组织中,foxa2表达量与mmp9表达量呈负相关。-6-【结论】1.FOXA2表达量在肝癌的发生、发展及转移过程中逐渐下降。2.FOXA2可抑制肝癌细胞的EMT,有效抑制肝癌的转移。3.FOXA2部分通过下调MMP9基因表达抑制肝癌转移。4.FOXA2可作为临床干预肝癌转移的潜在作用靶点。