目的:人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor type 2,HER2）是肿瘤诊疗的重要靶点之一。应用放射性核素标记HER2受体靶向分子,如抗体或抗体片段、短肽和支架蛋白等分子探针显像可对HER2阳性肿瘤进行诊断与治疗。本研究旨在探讨⁹⁹Tc^m标记表皮生长因子受体2小分子靶向结合蛋白ZHER2:V2与抗肿瘤药物培美曲塞偶联制备分子探针的方法及分析其在体外与HER2受体的结合特性。方法:应用Fmoc/tBu多肽固相合成法合成小分子靶向结合蛋白ZHER2:V2,N端与抗肿瘤药物培美曲塞偶联,其C末端连接上4个氨基酸,Gly-Gly-Gly-Cys-,形成N₃S结构的强螯合基团,利用配体交换法进行⁹⁹Tc^m标记,制备⁹⁹Tc^m-ZHER2:V2-培美曲塞分子影像探针。用高液相色谱法与纸层析法分别分析测定该分子探针的标记率、放化纯度及体外稳定性。应用Real-time PCR检测人肺腺癌H2009和H23细胞HER2基因的表达。将探针与HER2高表达人肺腺癌H2009、A549细胞和HER2低表达人肺腺癌H23细胞相结合,选取1、2、4、6、12、24h进行体外细胞摄取、滞留、内化和阻断实验。摄取实验,将对数期生长的3种细胞分别接种于六孔板中,加入分子探针30ul/孔,培养至各时间点先收集上清,随后消化细胞并收集沉淀,测定摄取率。滞留实验培养方法及设计同前,选4h时间点换液后继续培养,然后测定滞留率。内化实验收集上清后加入PH为2.5醋酸冲洗复孔后收集冲洗液,然后消化细胞收集沉淀,测定内化率。阻断实验选取时间点4h时,用过量未标记ZHER2:V2-培美曲塞分别对HER2高表达H2009、A549细胞进行阻断,并与未阻断组进行对比,观察摄取率,研究该分子探针与HER2靶向结合的特异性。所有计量资料用?x±s表示,采用两样本t检验处理,数据采用SPSS 21统计软件进行分析。P值<0.05有统计学意义。结果:⁹⁹Tc^m-ZHER2:V2-培美曲塞即刻标记率（97.11±0.24）%（n=6）,放化纯>97%;在生理盐水及血清中稳定性良好,大部分时间点放化纯>92%。Real-time PCR检测结果2^-??Ct=1.06437,H2009细胞表面HER2基因受体表达量大于H23细胞。H2009、A549HER2高表达细胞在不同时间点对⁹⁹Tc^m-ZHER2:V2-培美曲塞分子探针的摄取率随时间延长逐渐递增趋势,H2009、A549细胞摄取率多高于H23细胞,（t=7.846³0.793,P=0.010⁰.000;t=7.794⁵.353,P=0.001⁰.032）。分子探针在HER2高表达H2009、A549细胞中滞留时间较长,半清除时间皆为12h,滞留率分别从1h（84.71±2.21）%逐渐降至12h（43.87±3.39）%;1h（85.62±2.61）%逐渐降至12h（43.74±3.87）%;H2009、A549细胞缓慢内化,24h后内化率分别可达（45.5±0.94）%、（45.54±4.64）%,细胞膜结合能力较强,亲和力高。H2009细胞、A549细胞阻断实验加入过量未标记的ZHER2:V2-培美曲塞后,H2009细胞、A549细胞摄取率均明显下降,摄取率分别从（3.76±0.15）%逐渐降至（0.89±0.02）%（t=33.452,P=0.000）;（2.03±0.39）%逐渐降至（0.01±0.00）%（t=9.000,P=0.012）。结论:⁹⁹Tc^m-ZHER2:V2-培美曲塞分子探针标记方法简便易行、标记率高、体外稳定性好,体外HER2高表达肺腺癌细胞摄取率高、滞留时间长且能与HER2靶向特异性结合,是一种生物性能良好的有潜在临床应用价值的新型HER2靶向分子影像探针。