肝脏是机体最大的实质性器官,接受25%的心脏输出血液,具有门静脉和肝动脉双重血供,供血量非常丰富。自1908年Pringle报道在肝切除术中应用控制肝十二指肠韧带的止血方法以来,肝脏对缺血耐受的时限及肝内不同细胞群体对缺氧的耐受性差别受到普遍关注,至今仍有较大争论。肝脏缺血再灌注常见于创伤、休克、及多种复杂肝脏手术,特别是用Pringle手法阻断肝血流切除大的肝内病灶和肝移植手术。在肝脏血供恢复后,肝脏受到进一步的“打击”,发生缺血再灌注损伤(hepatic ischemical reperfusion injury, HIRl)。HIRI发生机制复杂,炎症反应被认为是HIRI的实质。肝脏缺血再灌注时肝细胞发生代谢功能障碍,各种炎性因子生成,大量氧自由基生成,同时门静脉系统淤血,肠粘膜屏障功能障碍。再灌注后含有毒素的门静脉血流入肝产生损害作用,激活免疫细胞分泌大量炎性介质,炎性介质反向促进免疫细胞的激活。炎性介质和缺氧状态作用于肝脏细胞并可能产生复杂的病理生理过程。本文主要通过观察肝缺血再灌注不同时限大鼠肝脏和小肠的病理形态学变化及检测肝脏及小肠标本中的巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflamationg protein-1 a,MIP-1α)、缺氧诱导因子1 a (hypoxia inducible factor-1 a, HIF-1 a)的表达变化,探讨其相关性,并对二者在肝缺血再灌注损伤发生中的意义及相关机制进行探讨。目的通过建立SD大鼠肝脏缺血-再灌注损伤模型,观察大鼠肝脏缺血45min后再灌注不同时限肝脏及小肠的病理形态学变化,免疫组织化学方法检测MIP-1α和HIF-1a在肝脏及小肠组织中的表达情况,观察MIP-1a和HIF-1a在HIRI时表达的时空分布特点,进一步了解炎性损伤及氧化应激在肝脏缺血及再灌注时对肝脏缺血所致的消化道淤血性损伤以及后者对肝脏的再灌注损伤时发挥的作用。方法1.实验分组成年健康SD雄性大鼠55只,随机分为三组：正常组(n=5)、缺血再灌注组(n=25)、假手术组(n=25),缺血再灌注组和假手术组又根据缺血再灌注后不同时限点(0h、3h、12h、24h、72 h)随机分为5个亚组,每组5只。2.动物模型建立术前禁食12h,自由饮水；正常组：处死后进腹直接取材。缺血再灌注组：术前处理同正常组,行腹腔内注射麻醉(3%戊巴比妥钠40mg/kg),取上腹3 cm正中切口,进入腹腔游离并用无损伤动脉钳夹闭肝蒂45min后放开动脉钳,再灌注0h组进腹后直接取材,其余大鼠切口给予缝合,继续饲养,于各再灌注时限点(3h、12h、24h、72h)取材。假手术组：术前处理及麻醉方法同缺血再灌注组,进入腹腔后仅游离肝蒂但不阻断,取材方法及时限点同缺血再灌注组。3.观察指标与方法①光镜下病理变化观察：10%福尔马林固定大鼠肝脏及小肠标本(上段空肠组织长约5cm),梯度酒精脱水,石蜡包埋后,常规连续切片。切片行HE常规染色。②超微病理变化观察：肝脏及小肠电镜标本取材后放于3%戊二醛中固定20min修块取材,SPURR低粘度包埋剂浸透包埋聚合。组织标本行扫描电镜观察。③MIP-1α和HIF-1a表达检测——免疫组织化学SABC法：检测试剂盒购于武汉博士德生物制品公司。MIP-1a免疫组化结果以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达。HIF-1a阳性判断标准为胞质棕黄色颗粒沉着,少量核染色。每张切片取10个200倍视野运用HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统行免疫组化染色阳性反应产物定量分析,记录阳性单位(positive unit, PU),并取其平均值,以PU值表示阳性产物表达的多少。4.统计处理所有计量数据均以平均值±标准差(x±s)表示,计算基本统计量,所有实验组用析因设计的方差分析比较主效应和交互效应后,多重比较采取LSD法进行检验,P<0.05表示结果具有统计学意义。双变量相关分析(Bivariate)两变量间相关性。采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,P<0.05代表有统计学意义。结果1.HE染色光镜下观察：正常组及假手术组的肝脏结构基本完整。缺血45min再灌注即时可见肝细胞轻度水肿,肝窦间隙开始狭窄；3h时可见肝细胞肿胀,胞质半透明、疏松呈网状；12h时肝细胞呈弥漫性肿大,水样变,肝小叶内可见点状坏死与嗜酸性小体形成；24h时肝细胞损伤最重,可见肝小叶变形,肝板破坏,部分出现片状坏死；72h时可见肝窦间隙狭窄减轻,肝小叶重构。正常组小肠结构完整,再灌注0h可见小肠上皮下间隙扩大,毛细血管充血,上皮与固有层出现分离,腺体轻度受损；3h腺体受损明显,伴部分顶部绒毛脱落；12h上皮与固有层分离明显,大部分腺体受损,毛细血管开始扩张；24h绒毛明显脱落,固有层部分消化、分解；72h小肠结构虽仍有部分受损,但基本恢复正常。2.超微病理观察：电镜下正常对照组及假手术组肝脏及小肠组织超微结构形态基本正常；肝脏缺血45min再灌注即时电镜下即可见到线粒体及内质网轻度肿胀；3h时可见线粒体嵴变短,肿胀加重,核染色质浓缩边集；12h时可见细胞核皱缩,糖原消失；24h时可见少数肝细胞固缩死亡及新生的肝细胞；72h时肝细胞超微结构基本恢复正常,但线粒体仍稍肿胀。肠粘膜上皮细胞3h见腺体轻度受损,线粒体嵴变粗；12h时表现为线粒体明显肿胀,细胞核固缩；24h时线粒体嵴溶解呈泡状,严重呈散乱絮状；72h时小肠细胞超微结构基本恢复正常。3. MIP-1α在正常组及假手术组肝脏及小肠组织中未见明显表达,两组差异无统计学意义(P>0.05)。再灌注0小时在肝血窦及中央静脉周围组织中可见表达,随再灌注时间的延长,阳性表达逐渐增多,在再灌注12h时达到峰值,随后逐渐下降,至72h下降明显但仍高于再灌注初期。在小肠组织,MIP-1α再灌注初期可见表达,至24h达到高峰,72h下降至正常水平。MIP-1α在小肠组织中的表达主要集中在固有层,肌层血管周围亦可见其表达。再灌注组MIP-1α的表达与正常组及假手术组相比有统计学意义(P<0.05)。4. HIF-1α在正常组与假手术组各时限点肝脏及小肠内未见明显表达,两组差异无统计学意义(P>0.05)。缺血再灌注组SD大鼠肝脏再灌注0h时汇管区微血管、微胆管周围细胞浆中可见棕黄色阳性表达,12h时肝细胞内广泛阳性表达。随再灌注时间延长,阳性表达细胞逐渐减少,至72h基本恢复正常。小肠组织阳性表达主要集中在肠粘膜细胞,再灌注初期即开始表达,随时间延长阳性表达逐渐增多,至24h达峰值,72h降至再灌注初期水平。再灌注组HIF-1α的表达与正常组及假手术组相比有统计学意义(P<0.05)。5.缺血-再灌注组,肝脏组织中MIP-1α、HIF-1α呈显著正相关关系(r。=0.72 P<0.05)；小肠组织中MIP-1α、HIF-1α呈显著正相关关系(r。=0.97P<0.05)。结论各种原因引起的一定程度的肝脏缺血当再灌注期血供恢复后,肝脏细胞功能代谢障碍及组织结构破坏进一步加重,在这一过程中大量炎性细胞浸润、激活释放炎性介质参与组织损伤。HIF-1α在多种组织缺氧应激状态下表达,并通过调节其他细胞分子的表达而对组织细胞发挥作用。MIP-1α属于CC趋化因子一员,肝脏Kuffer细胞可以分泌MIP-1α并引起炎性细胞的聚集,促进组织炎性损伤。HIF-1α与目的基因结合后,调节相关基因的表达,使细胞对缺氧的适应能力增强,其表达增强可能与多种疾病的细胞凋亡损伤有关。本实验中,在正常组及假手术组大鼠肝脏及小肠组织中HIF-1a表达细微。缺血再灌注后,HIF-1α在肝脏及小肠组织均有明显表达。HIF-1a的首先表达部位可能与肝窦间隙、微胆管、中央静脉区组织细胞血供较差,氧浓度较低,阻断肝血流后缺血缺氧性损伤最先累及该区域有关。而在小肠组织中,肠粘膜细胞微绒毛处的血供最差,最易引起缺血缺氧性损害,故成为HIF-1a最先表达的部位。HIF-1a和MIP-1a表达的正相关性表明,HIF-1a作为转录调节因子可能通过促进MIP-1a等趋化因子的表达从而增强炎症反应过程,HIF-1a可能是MIP-1α表达的重要调节因子。有研究表明HIF-1α可使细胞自发激活上调炎性蛋白表达而增强上皮炎性反应,并参与了骨髓细胞的增殖分化过程。MIP-1a等趋化因子的表达增强使炎性细胞向炎性损伤部位聚集,炎性细胞与内皮细胞粘附导致微血管出现无复流现象,进一步加重组织缺氧。HIF-1a与MIP-1a在小肠组织与肝脏组织中表达峰值时相及表达恢复情况的差异原因,考虑可能因为门静脉系统淤血造成胃肠道循环系统微小血栓形成,在肝门开放后,胃肠道继续存在部分缺血缺氧情况,从而影响胃肠道炎性损伤的恢复所致。本研究结果表明肝脏的缺血不仅可造成肝脏实质性及非实质性细胞的自身损伤,而且可造成消化道的损伤。在再灌注初期,肝脏血流再通后各种途径产生的氧自由基对肝细胞损伤起主要作用。在小肠组织中,随着肝门阻断时间延长,门静脉系统淤血程度的增加造成消化道缺氧；小肠组织有氧代谢障碍产生的活性氧簇使小肠组织受损,活性氧簇通过脂质过氧化、促进中性粒细胞聚集及抑制线粒体功能加速细胞能量的消耗等作用导致小肠粘膜细胞损伤。此外,消化道的淤血性损伤也可能是造成肝脏复流后再灌注损伤的重要原因之一,因为消化道产生的氧自由基及各种炎性介质可随着再灌注后的门静脉血流进入肝脏,进而加重肝脏的损伤；二者互为因果,造成肝脏的缺血再灌注损伤和机体整体的氧化应激反应。本研究通过对肝脏缺血再灌注不同时相肝脏与小肠病理形态变化及同期HIF-1α、MIP-1a表达变化分析,提示：肝脏缺血再灌注可以引起小肠组织的损伤；肝脏及小肠组织的损伤与炎性细胞聚集及缺氧应激状态有关。低氧环境及炎性反应共同促成肝脏缺血再灌注时肝脏及消化道应激反应,其中HIF-1a和MIP-1a发挥了重要作用。因而减轻肝脏组织细胞的缺血缺氧和炎性反应状态可作为改善肝缺血再灌注损伤的重要环节。