脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar ataxia, SCA)是一大类呈常染色体显性遗传的,具有高度临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病。该病多在30岁至40岁左右发病,主要病理改变是小脑和脑干的萎缩,以进行性小脑性共济失调、走路不稳、构音障碍为主要临床表现,有时伴有眼肌麻痹、认知功能障碍、周围神经病、锥体束征和视网膜色素变性等表现。到目前为止,人类已经发现30多种SCA亚型。在前期工作中,我们对中国汉族人群SCA各亚型的分布频率及各亚型CAG重复次数的特点,制定了一套SCA基因诊断流程,建立了SCA致病基因的诊断平台。结果发现,在中国汉族人群中,SCA3最为常见,其次为SCA2、SCA1和SCA7等亚型。近几年,以全基因组外显子测序技术(Whole exome sequencing,WES)为代表的新一代测序技术具有高通量、高精度、高灵敏度、低运行成本等突出技术优势,为人类遗传疾病的研究开辟了又一个新途径。2010年,我们课题组在国际上率先联合应用连锁分析结果和外显子测序技术克隆了一个新的SCA亚型SCA35的致病基因TGM6,TGM6基因的两种错义突变D327G和L517W都可以致病。2012年,香港学者发现TGM6的另外一种形式的错义突变D150H也可以导致SCA的发生,更进一步证实了我们前期工作的可靠性。TGM6编码的转谷氨酰胺酶6蛋白(Transglutaminase6, TG6)属于转谷氨酰胺酶家族(Transglutaminases, TGs)。TGs是一类钙离子依赖性的转谷氨酰胺酶,在哺乳动物中有活性的TG共8种,主要催化谷氨酰胺上的甲酰胺基团与多种亲核基团反应。TG6在2001年才首次被人类发现,目前尚无关于TG6蛋白的功能研究。为进一步研究TGM6基因突变在SCA35亚型中的发病机制,我们通过过表达野生型及突变型TG6蛋白的细胞模型,进行相关的一系列体外功能实验,包括Western blot检测蛋白表达及TG6蛋白的降解,TG蛋白酶活性检测,细胞免疫荧光观察其亚细胞定位,GST pull down及免疫共沉淀寻找其相互作用的蛋白以及探讨TG6蛋白在细胞凋亡中的作用等研究。结论：(1)成功构建了野生型及两种突变型TGM6重组真核、原核表达载体,为研究野生型TG6蛋白的生理功能及突变型TG6蛋白导致SCA35的发病机制奠定了基础。(2)通过脂质体将野生型及突变型TGM6重组真核细胞表达载体转染至HEK293细胞,Western blot技术检测TG6蛋白的表达,发现野生型及突变型TG6蛋白的表达量没有明显差异。(3)蛋白稳定性实验证实,突变型TG6蛋白结构稳定性降低,在体内很容易被降解,半衰期明显缩短。(4)细胞免疫荧光结果表明,野生型及突变型TG6蛋白主要位于细胞浆中,与线粒体、内质网、高尔基体没有明显的共定位。(5)TG活性检测发现,突变型TG6蛋白的TG活性较野生型明显下降,尤其以L517W突变体的活性降低最为显著。(6)在HEK293细胞中,野生型及突变型TG6蛋白与polyQ蛋白(ataxin-3-20Q、ataxin-3-70Q、Htt-150Q)存在着部分共定位；GST pull down及免疫共沉淀结果表明,野生型及突变型TG6蛋白与polyQ蛋白之间存在着相互作用；且均能通过促进polyQ蛋白由可溶性转变为不可溶进而促使其形成细胞内聚集体。(7)过表达TG6蛋白对HEK293和NIH3T3细胞的凋亡率没有显著影响。但在A23187和STS诱导的细胞凋亡中,稳定表达突变型TG6蛋白可以促进细胞凋亡。过表达突变型TG6蛋白的细胞,凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9的活化程度也较野生组高。提示突变型TG6蛋白可能通过促进凋亡相关蛋白的激活加速了细胞凋亡。图37幅,表16个,参考文献104篇