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PCR胚胎性别鉴定法经过多年的研究,已成为最具应用前景的性别鉴定及后代性比控制的技术。本研究以山羊为试验动物,针对新鲜胚胎与冷冻胚胎,分别进行非电泳PCR及ZFX/ZFY双扩增PCR性别鉴别技术研究,并对性别鉴定后的胚胎进行玻璃化冷冻保存及移植,以形成山羊早期胚胎性别鉴定及鉴定后胚胎玻璃化冷冻保存技术。
研究表明:
1.根据山羊SRY基因序列设计的特异性引物,采用非电泳PCR法对新鲜胚胎进行性别鉴定,其鲜胚活体取样有效率为98.3%(116/118),性别胚胎(鲜胚)移植产羔率为33.9%(19/56),非电泳PCR性别鉴定准确率为94.7%(18/19)。
2.通过将鹿茸提取物和转化生长因子(TGF—β1)分别以不同浓度添加到含10%FCS的PBS基础培养液中,对经显微切割取样后的山羊早期胚胎进行体外修复试验。结果表明,添加鹿茸提取物组(15μg/ml),囊胚发育率为71.4%(12/14),显著高于对照组(未经处理)46.7%(7/15)(P<0.05)和添加TGF—β组(30ng/ml)50.0%(8/16)(P<0.05)。
3.根据牛、羊的ZFX及ZFY基因设计出ZFX/ZFY双扩增引物,用已知性别的牛、羊的血液基因组DNA模板检测,并进行山羊早期胚胎性别鉴定及性别胚胎的冷冻保存和移植试验。结果表明,胚胎PCR性别鉴定准确率为100%(7/7)。
4.以小鼠早期胚胎为对象,进行玻璃化液和玻璃化冷冻方法的筛选优化。结果表明,以ES1FS240为玻璃化冷冻保护液,采取二步玻璃化冷冻,一步解冻法能获得较高的小鼠胚胎发育率。按此技术方案对山羊性别胚胎进行玻璃化冷冻保存,其解冻复苏率为66.7%(10/15),体外培养囊胚发育率为53.3%(8/15),性别冷冻胚胎移植产羔率为37.5%(3/8),与新鲜完整胚胎移植结果44.4%(8/18)差异不显著(P<0.05),性别鉴定准确率为100%。