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脑缺血为脑部血管阻塞引起脑部血流受阻所导致的疾病,是当今世界上致残的主要疾病之一。然而迄今为止,除了组织型纤溶酶原激活剂(the tissue plasminogen activtor,tPA),临床上尚无其他的治疗脑缺血的有效药物。开发有效的脑缺血治疗药物需要对脑缺血的疾病状态有更加深入的了解,而目前关于脑缺血的病理生理过程以及相关的分子机制研究还比较薄弱。一直以来缺血后的治疗以急性期治疗为主,但是很多急性期治疗方案的效果有限,有些甚至有很强的副作用,因此近几年来新兴起不少延迟给药的治疗方案,虽然研究成果尚未可观,但可能是以后治疗脑缺血的一个很有潜力的研究方向。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)是一种蛋白酶家族,主要通过改变组蛋白的乙酰化水平,调控染色体的结构和基因表达,另外其部分亚型还调控细胞内其他物质的乙酰化水平从而发挥相应的生物学效应。在以往的研究中,很多报道以及我们实验室的研究都证明了HDAC家族与神经发生、学习记忆等密切相关,但是关于HDAC在脑缺血中作用的研究还很少。为此,我们设计了两部分研究内容:(1)研究脑缺血后延迟给予HDAC抑制剂辛二酰苯胺氧肟酸(Suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA,Vorinostat)是否有助于运动功能的恢复,基于其作用,研究关键的HDAC亚型在脑缺血后的变化以及干预该亚型对脑缺血后运动功能恢复的影响;(2)探讨HDAC2影响脑缺血后运动功能恢复的细胞及分子机制。第一章:延迟干预HDAC2影响脑缺血后运动功能的恢复为了研究缺血后延迟干预HDAC对于运动功能恢复的影响,我们应用了HDAC抑制剂SAHA。采用光诱导血栓形成性脑缺血模型(Photothrombotic stroke),在模型制备后3 d到9 d通过微量给药系统给予SAHA,10 d、17 d和24 d采用网格实验和圆筒实验检测运动功能的改变。结果显示,给予SAHA显著降低了缺血后网格实验的失足率和圆筒实验的不对称指数,促进了运动功能的恢复。SAHA可以特异性的抑制HDAC1、2和6三种亚型,那么SAHA延迟给药所发挥出的改善运动功能的作用是通过哪个亚型实现的呢?我们首先验证了延迟抑制HDAC6的效应。应用了HDAC6特异性抑制剂Tubastatin A(TubA),通过微量给药系统连续七天给予小鼠TubA,之后检测注射部位HDAC6活性的改变,发现其活性降低,证明TubA降低了HDAC6的活性。而后我们在脑缺血后1 d、3 d、7 d和14 d检测缺血周围区HDAC6的表达水平,并未发现有明显的改变。最后,我们采用光诱导血栓形成性脑缺血模型,在3 d到9 d通过微量给药系统给予TubA,10 d、17 d、24 d和31 d利用网格实验和圆筒实验检测运动功能的改变。结果发现延迟给予HDAC6特异性抑制剂之后,运动功能并没有明显的改善。结果表明,脑缺血后延迟给予SAHA有助于运动功能的恢复,而该作用并非是通过抑制HDAC6实现的。为了研究HDAC2在脑缺血后是否发生了改变,我们进行了如下的实验。首先,我们体外培养原代神经元,于体外培养第九天制备谷氨酸诱导的兴奋性毒性损伤模型,于模型制备后1 h、2 h、3 h和4 h检测HDAC2的表达,发现3h、4 h HDAC2的表达有明显的下降,说明体外脑缺血后数小时内HDAC2表达水平显著降低。那么长时间后这种降低是否能翻转呢?于是我们采用了更能模拟真实的脑缺血情况的氧糖剥夺(Oxygen and glucose deprivation,OGD)模型来验证这一点。对体外培养第八天的神经元进行OGD 40 min,分别于OGD后4 h、8 h、24 h和72 h检测HDAC2的表达水平,发现4 h、8 h、24 h、72 h四个时间点HDAC2的表达虽然有所回升,但是与对照组比较还是降低的(4 h、8h、24 h三个时间点有差异)。以上结果表明在体外的脑缺血模型上HDAC2的表达水平短时间降低后逐渐回升。接着,我们在整体动物上研究了脑缺血对HDAC2表达水平的影响。采用了光诱导血栓形成性脑缺血模型,在脑缺血后1 d、3 d、7 d和14 d分别检测缺血周围区和缺血核心区HDAC2的表达。结果表明在脑缺血后缺血核心区的HDAC2表达呈现下降的趋势,可能是由于细胞的大量死亡引起的,但是3 d、7d、14 d缺血周围区的HDAC2表达有显著的升高,这种升高很可能对脑缺血的治疗有重要的意义。缺血后3 d、7 d、14 d缺血周围区的HDAC2表达升高,其活性变化又是怎么样的呢?因此我们于光诱导血栓形成性脑缺血模型制备后1 d、3 d、7 d和14d检测缺血周围区HDAC2活性的变化。研究表明缺血后HDAC2活性呈现上升的趋势,于7 d时最为显著。综上所述,脑缺血后缺血周围区HDAC2的表达和活性升高。缺血后表达和活性升高的HDAC2是否是SAHA起作用的主要靶点呢?接下来我们应用了LV-HDAC2-shRNA-GFP来证实干预HDAC2在脑缺血后功能恢复中的作用。该慢病毒应用于小鼠或者神经元上都能显著地降低HDAC2的表达,并且有很好的感染效果。脑缺血后即刻给予LV-HDAC2-shRNA-GFP,于缺血后7 d、14 d、28 d、42 d检测运动功能的改变。发现相对于LV-GFP组,LV-HDAC2-shRNA-GFP组运动功能有显著的改善,说明缺血后阻断HDAC2的表达有助于运动功能的恢复。而后,我们又采用了重组腺病毒AD-HDAC2-Flag来进一步验证HDAC2的作用。该腺病毒可以显著增加HDAC2的表达而其对照病毒AD-inactive-HDAC2-Flag不影响HDAC2的表达。脑缺血后即刻给予AD-HDAC2-Flag,于缺血后7 d、14 d、21 d检测运动功能的改变。AD-HDAC2-Flag组小鼠运动功能的改善显著差于AD-inactive-HDAC2-Flag组小鼠,说明缺血后过表达HDAC2不利于恢复。第二章:HDAC2调控缺血后功能恢复的机制采用光诱导血栓形成性脑缺血模型,在脑缺血后1 d、3 d、7 d和14 d检测缺血周围区Synapsin和Spinophilin的表达水平,发现两者的表达都有显著的降低。接着,我们在脑缺血后即刻给予LV-HDAC2-shRNA-GFP和AD-HDAC2-Flag,观察Synapsin和Spinophilin的表达变化,结果显示脑缺血后Synapsin和Spinophilin的表达降低,给予LV-HDAC2-shRNA-GFP逆转了其表达的降低。提示了脑缺血后干预HDAC2影响突触发生。为了进一步验证这一猜想,我们在脑缺血后即刻给予LV-HDAC2-shRNA-GFP,于缺血后14 d取脑,进行高尔基染色,观察树突棘密度、树突总长度、树突总分支数以及树突复杂度。结果表明脑缺血后如果阻断HDAC2表达则树突棘密度、树突总长度、树突总分支数以及树突复杂度显著增加。而OGD后给予LV-HDAC2-shRNA-GFP则显著减少了细胞凋亡。以上结果提示阻断HDAC2表达从而促进脑缺血后运动功能恢复的作用可能是通过改善缺血周围区的树突生长、突触发生以及减少细胞凋亡来实现的。结论:(1)脑缺血后延迟给予SAHA有助于运动功能的恢复,而其作用很可能是通过抑制HDAC2实现的;(2)延迟干预HDAC2可能是通过增强缺血周围区的树突生长和突触可塑性并且减少细胞凋亡实现促进缺血后功能恢复的作用。