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背景香烟烟雾(CS)是慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病的重要因素。Wnt/β-catenin信号异常可能促进慢性阻塞性肺疾病的进展。已有许多研究报导COPD患者microRNAs(miRNAs)的表达异常。研究异常的miRNAs及其在COPD进展中的潜在作用可能为COPD治疗提供新的策略。目的探寻与COPD发病相关的miRNA,以香烟烟雾提取物(CSE)处理人支气管上皮细胞(BEAS-2B)验证得出miR-130a在COPD中起重要作用,进一步探索miR-130a通过作用于Wnt信号通路促进COPD发展,并在小鼠体内验证。本研究探索香烟烟雾通过影响miRNA及下游信号通路导致慢性阻塞性肺疾病的发生机制,并为吸烟致COPD的防治提供理论依据。方法细胞实验(1)从NCBI GEO网站下载了 GSE 44531,并分析了在非疾病和COPD样本中差异表达miRNAs的变化,选出与COPD相关的10种miRNAs,以香烟烟雾提取物(CSE)处理BEAS-2B细胞,与以磷酸盐缓冲液(PBS)处理的细胞对比,以RT-PCR检测验证这10种miRNAs在2组细胞中的表达,挑选出表达上调最多的miRNA,即miR-130a。(2)PBS 和 CSE 分别处理细胞,用 miR-130a mimics、miR-130a inhibitor及相应的阴性对照物转染细胞,以MTT法和划痕实验探索过表达或抑制miR-130a后对细胞增殖及迁移能力的影响。(3)将细胞分为4组,分别转染mimics-NC、miR-130a mimics、inhibitor-NC、miR-130a inhibitor,用免疫印迹法检测这4组细胞中Wnt/β-catenin通路中重要的3种蛋白质的表达,包括WNT1、β-catenin和LEF1。再以PBS和CSE分别处理细胞,用miR-130a inhibitor及inhibitor-NC转染细胞,以免疫印迹法检测蛋白WNT1、β-catenin、LEF1水平。(4)查询GenBank中的人类靶基因序列,预测miR-130a与WNT1 3’UTR的结合位点,对结合位点进行突变,分组为wt-WNT1组(野生组)和mut-WNT1组(突变组),以HEK 293细胞(人胚肾上皮细胞系)进行荧光素酶报告实验,验证miR-130a与WNT1 mRNA在该位点结合。以RIP(RNA免疫共沉淀)实验验证miR-130a下调WNT1。(5)以si-WNT1/si-NC和miR-130a inhibitor/inhibitor-NC 同时共转染经 CSE 处理的 BEAS-2B 细胞,再以 MTT法及划痕试验来检测细胞的增殖和迁移能力,进一步探索及验证miR-130a和Wnt/β-catenin信号在CSE诱导的细胞损伤中的动态作用。动物实验建立香烟烟雾暴露诱导的小鼠肺气肿模型,以特异性anti miR-130a或PBS对小鼠鼻腔内给药,处死小鼠后取肺组织制作石蜡固定切片进行HE染色及观察形态,取一侧肺的新鲜肺组织行PCR检测分析肺组织中的miR-130a和Wnt1 mRNA的表达量,另一侧肺进行灌洗,得到支气管肺泡灌洗液(BAL),检测BAL中的所有细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量。结果(1)与COPD相关的miRNA筛选及验证:CSE处理的细胞miR-130a表达上调最多。(2)miR-130a抑制剂可以缓解CSE对BEAS-2B细胞迁移和增殖的抑制作用。(3)miR-130a过表达可以抑制Wnt/β-Catenin信号。抑制miR-130a可以减少CSE对Wnt/β-Catenin信号的抑制作用。(4)预测到miR-130a与WNT1 3’UTR存在结合位点,wt-WNT1 3’UTR报告载体的荧光素酶活性可被miR-130a过表达显著抑制,而抑制miR-130a后报告载体的荧光素酶活性增强,突变组荧光素酶活性的变化被取消。RIP实验结果:miR-130a mimics组的WNT1表达显著高于mimics-NC组。由此可知miR-130a通过预期结合位点调控WNT1。(5)WNT1沉默可抑制细胞迁移和增殖,miR-130a抑制剂可显著促进细胞迁移和增殖,WNT1沉默可部分逆转miR-130a抑制剂对细胞迁移和增殖的促进作用。(6)CS组小鼠miR-130a表达显著高于Air组,CS组小鼠Wnt1 mRNA表达显著低于Air组,miR-130a和Wnt1 mRNA的表达呈负相关。(7)在BAL中,接触CS可显著增加BAL细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量。使用miR-130a抑制剂显著减少了 CS诱导的BAL中上述细胞的增加。结论本研究通过细胞实验及动物实验两方面来探索并验证了香烟烟雾通过上调miR-130a靶向作用于WNT1,抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而抑制了肺组织的修复,从而促进了慢性阻塞性肺疾病的发展。miR-130a/WNT1通路可能成为香烟烟雾导致的慢性阻塞性肺疾病治疗的新靶点。