恶性实体瘤的生长、侵袭及转移等恶性生物学特性要依赖于肿瘤的血管生成作用，试验表明通过抑制肿瘤的血管形成可以抑制恶性肿瘤的生长和转移，因此抗血管生成治疗已逐渐成为肿瘤治疗领域中颇具前景的一类治疗方法，近年来，随着对血管生成调控机理研究的深入，一大批对肿瘤血管生成有抑制作用的药物被逐渐发现和应用，其中血管抑素是新近发现的对肿瘤血管生成抑制作用最为强烈的抑制因子之一，它是由O’Reilly首先从荷瘤小鼠血清中分离得到的，研究表明血管抑素能通过抑制新生血管内皮细胞的增殖等作用机制干扰肿瘤的血管形成，从而抑制原发肿瘤的生长，肿瘤细胞由于缺血、缺氧，发生退化萎缩，肿瘤体积缩小，并最终使肿瘤组织转入休眠态，其疗效已经超过目前用于临床实验的最有效的血管生成抑制剂TNP-470。近年来，随着基因转入技术的成熟，基因治疗技术开始在肿瘤的抗血管生成治疗领域被应用，以血管抑素为靶基因的抗肿瘤血管生成基因治疗相继获得成功，由于它克服了单纯使用血管抑素蛋白质药物需反复多次给药、成本昂贵以及不能获得长期稳定的疗效等缺点，因此这一治疗方法已成为肿瘤抗血管生成治疗中的一个主要手段。然而，研究表明，血管抑素本质上是纤溶酶原经酶切、还原及水解后产生的一个内部片段，体内没有任何细胞能直接分泌产生具有生物活性的血管抑素，因此单纯将血管抑素的cDNA基因 第四军医大学硕士学位论文转染入宿主细跑，未必能使细胞产生和分泌出有生物活性的血管抑素，从而使碍这一治疗方法不一定能获得预期的疗效。进一步对体内血管抑素产生机制的研究表明，肿瘤组织中侵润的巨噬细胞可分泌一种基质金属蛋白酶——巨噬细胞金属弹性蛋白酶，即删P－12，它能通过直接裂解组织间质中的纤溶酶原产生有生物活性的血管抑素，因此如果能将MMP－12基因转染相应的细胞中并获得表达，它将有可能通过产生血管抑素来间接达到抑制肿瘤血管生成的作用，目前这一假设己获得多个试验的证实，而这又将为肿瘤的抗血管生成基因治疗开辟一个新的途径。 原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，由于肝癌具有特殊的双重供血系统，因此它也是体内最富有血管的实体瘤之一。试验研究表明，抑制肝癌的血管生成可以促进肝癌细胞的凋亡，减少肝癌的侵袭及转移，因此研究肝癌的抗血管生成治疗为探索有效治疗肝癌的方法提供了一条新的道路，尤其是在肝癌抗血管生成基因治疗中如何选择一个合适的靶基因成为目前肝癌生物疗法中的一个关键问题。为了探讨人巨噬细胞金属弹性蛋白酶（HME）在肝癌抗血管生成基因治疗中的作用及机制，本实验通过从腹水中分离纯化的巨噬细胞中提取总RNA，经RT干CR获得HME的基因片段克隆，利用限制性内切酶及连接酶技术将其连接到真核表达载体pCDNA3．1（－风上，从而构建了一个包含HME基因的重组真核表达载体 pCDNA3．1（－）A／HME；利用脂 质体基因转染技术将PCDNA3．1（－）A／HME导入人肝癌细胞株SMMC－7721中，经G418 筛选抗性克隆，以免疫组化证实 HME在 SguC－772中获得稳定表达；将稳定表达HME的SWCf721肝癌细胞种植于免疫缺陷小鼠SCid ’J’鼠皮下，观察肿瘤细胞的成瘤性变化，通过兔疫组化检测肿瘤组织中HME表达及血管抑素的产生情况，并计算肿瘤组织中的微血管密度变化来进一步探讨HME抗肝癌血管生成的机制。 第．4－页 第四军医大学硕士学位论文 实验结果如下：l、经过酶切鉴定及序列分析证实己成功地将HME基因克隆入真核表 达载体PCDNA3．l卜V，并获得重组真核表达载体 PCDNA3．l（刁A／HME；2、利用脂质体将重组载体pCDNA3．l（刁A／HME转染到肝癌细胞 SWC－7721中，以G418持续筛选4周，获得稳定生长的抗G418 转染细胞，以免疫组化证实HME在转染细胞中获得稳定表达；3、习 三组人肝癌细胞（SMMC－7721、SMMC－7721／pCDNA3．1（－）A。 SMMC－7721／PCDNA3．1（－）A／HME）用不含G41S的培养基常规培养， 生长曲线显示：转染细胞和未转染细胞的生长速度无明显差别， 表明HME对人肝癌细胞SMMC－7721本身生长无抑制作用。4、转染HME基因的SWC－7721肝癌细胞在SCid小鼠皮下的成瘤性 明显降低：肿瘤生长缓慢，肿瘤的体积、重量和微血管密度显著 低于对照组，以免疫组化观察到肿瘤组织中有大量重组HME表达， 并在肿瘤组织间质中产生大量的血管抑素，明显高于对照组中的 血管抑素含量。 本实验通过体外基因转导的方法，在国内首次阐明了删P－12在肝癌血管生成中的初步作用机制，即表达后的重组 MMP－12可通过裂解间质中的纤溶酶原产生血管抑素，抑制和干扰肝癌的血管生成作用，从而降低肝癌细胞的致瘤性。我们的实验结果进一步丰富了肝癌血管生成过程中的调节机理，并为进一步研究肝癌的抗血管生成基因治疗提供了一个新的策略。