羊传染性脓疱皮炎（Contagious ecthyma,CE）又称羊口疮（Orf）,是由羊传染性脓疱病毒（Contagious ecthyma virus,CEV）引起的一种羊接触性、嗜上皮性传染病。该病对羊的采食影响极大,导致患病羊衰弱甚至死亡。该病在世界各养羊国家均有流行,严重影响了养羊业的经济效益。CE至今仍无特效治疗药,疫苗免疫是防控该病的理想手段,但目前国内尚无安全有效的商品化CEV疫苗。针对CEV的免疫主要为细胞免疫,故传统的灭活疫苗作用有限甚至无效,而传代减毒活疫苗由于其致弱机制尚不明确,存在毒力返强风险,难以保证疫苗的安全性。因此,采用基因敲除技术,对CEV的主要毒力基因进行缺失,构建毒力基因缺失的弱毒候选疫苗株,是目前CEV疫苗的重要研究方向。趋化因子结合蛋白（CBP）与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抑制蛋白（GIF）是CEV的两个重要毒力蛋白,其中CBP为感染早期表达的蛋白,而GIF在病毒感染的中晚期表达,这两个毒力蛋白对CEV逃避宿主免疫系统的监视与清除起着重要作用。有研究表明缺失cbp基因可使CEV明显致弱,此外,CEV的疫苗株与强毒株的gif基因有明显差别。因此,本研究拟采用同源重组技术,敲除CEV的cbp基因和gif基因,构建CEV cbp/gif双基因缺失毒株rGS14ΔCBPΔGIF,以期获得安全、有效的羊口疮病毒基因缺失活疫苗候选疫苗株,为我国的羊口疮疫情防控提供技术支撑。本研究采用CEV GS14株的DNA作为模板扩增出cbp与gif基因的上下游同源臂,并从EGFP-N1质粒中扩增含同向lox P位点的GFP表达框,使用融合PCR的方法将上述3段序列连接后,转染入感染了CEV的羊睾丸原代细胞,筛选带荧光的单基因缺失株rGS14GFPΔCBP及rGS14 GFPΔGIF并进行纯化。使用Cre重组酶敲除GFP表达框,筛选无荧光的重组病毒rGS14ΔCBP及rGS14ΔGIF并进行纯化。将获得的重组病毒rGS14ΔCBP按同样策略对gif基因进行敲除,经筛选、纯化和鉴定后,获得CEV双基因缺失重组病毒命名为rGS14ΔCBPΔGIF。对双基因缺失株rGS14ΔCBPΔGIF进行生物学特性研究,包括测定重组病毒的TCID50、观察其体外细胞病变情况（CPE）、测定一步生长曲线、采用建立的实时荧光定量PCR的方法绘制病毒含量曲线、测定重组病毒对山羊的安全性以及通过建立发病模型进行免疫攻毒保护试验。结果表明,重组病毒rGS14ΔCBPΔGIF株的TCID50为10-6.3/0.1m L,其体外CPE、生长曲线及病毒含量与亲本株GS14株无显著差异;将发病羊只口唇痂皮研磨病料处理后进行特异性、纯净性检验合格,用不同浓度的病料液接种CEV抗体阴性的1月龄山羊并观察21天,确定最低发病浓度为10-2,以此建立羊口疮的发病模型;分别以106TCID50的单基因缺失株rGS14ΔCBP株、rGS14ΔGIF株以及双基因缺失株rGS14ΔCBPΔGIF,划痕接种CEV抗体阴性的1月龄山羊口唇部位,每个毒株接种5只山羊,连续观察21天,结果所有山羊精神状态与采食无异常,均未出现任何局部和全身不良反应,证明3个毒株均具有良好的安全性;将20只1月龄羔山羊分为4组,每组5头,其中1～3组为免疫组,分别免疫105TCID50的2个单基因缺失毒株和1个双基因缺失毒株,第4组为未免疫对照组,免疫后21日,采用最小发病剂量的羊口疮病料研磨液进行攻毒,结果未免疫对照组全部发病,rGS14ΔCBP株免疫组保护率为40%（2/5）,rGS14ΔGIF株免疫组保护率为50%（2/4）,rGS14ΔCBPΔGIF株免疫组保护率为100%（4/4）,证明rGS14ΔCBPΔGIF株具有良好的免疫原性。本研究结果表明,CEV cpb/gif双基因缺失株rGS14ΔCBPΔGIF是理想的CEV基因缺失活疫苗候选疫苗株。