前言多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）是脑胶质瘤中恶性程度最高,综合治疗效果最差的一种亚型,是中枢神经系统中常见的恶性疾病。经过多年研究,尽管对该疾病认识与治疗手段一直在改进,但多形性胶质母细胞瘤的总体治疗效果仍然较差。目前规范的治疗手段为最大安全范围手术切除以及术后替莫唑胺（TMZ）化疗的模式,这一模式下的总体中位生存期仅从9个月提高到12-18个月。目前统计患者5年生存率仅为3-6.8%。因此,寻找新的治疗靶点、治疗手段成为目前该领域的研究重点。基因组、表观基因组、转录组和代谢组改变均可以在不同层面有效驱动肿瘤生长,这些改变是肿瘤组织区分于正常组织的重要特征。代谢组学中,能量代谢模式的改变最为典型,这一系列的代谢模式改变即代谢重编程（Metabolic reprogramming）。代谢重编程被认为是多数肿瘤的典型标志之一,并贯穿肿瘤发生、发展、治疗抵抗和肿瘤微环境等众多环节。肿瘤组织应用基础营养物质（葡萄糖、氨基酸和脂类）的模式均具有显著的特征性改变。其中又以“有氧糖酵解（Aerobic glycolysis）”这一过程最具有代表性。与正常组织代谢模式不同,肿瘤细胞在富氧条件下依然采取糖酵解作为主要供能方式,这一现象最早被Otto Warburg提出,命名为“Warburg效应”。为区分于一般糖酵解,这一过程因此也被称为“有氧糖酵解”。在有氧糖酵解过程中,肿瘤细胞依赖线粒体-胞浆中的穿梭系统来维持胞浆中NAD+（Nicotinamide adenine dinucleotide,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的浓度以保持高速率的糖酵解活动,在星形细胞分化而来的胶质瘤细胞中,这一主要穿梭系统为苹果酸-天冬氨酸穿梭系统（Malate-aspartate shuttle,MAS）,这一系统依赖线粒体、胞浆中的两对酶完成（MDH1/2,苹果酸脱氢酶1/2,GOT1/2,谷氨酰草酰乙酸转氨酶1/2）,这一途径是除了胞浆内NAD+再生以外重要的NAD+生成途径（占不同肿瘤的总NAD+生成量约30%-70%）。目前,靶向MDH1/2的抑制剂已经在临床前研究中展现出良好的抗肿瘤作用。但是目前对于MDH2的细胞内调控、上游机制等方面的研究尚不明确。非编码RNA（Non-coding RNA,ncRNA）在诸多生命活动中的作用被日益重视,除常见的核糖体RNA、转运RNA以外,其他非编码RNA最早被认为是转录过程中无意义的“噪音”片段,然而基因组研究表明,具备蛋白质编码能力的基因比例很少,大量基因间或反义链等编码的所谓“无意义片段”,实际上参与了细胞内众多的分子生物学活动,展现出不亚于各类功能蛋白的重要调控功能。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）则是特指长度在200nt以上、无编码能力的一类非编码RNA,主要通过四类机制,即:signal（模拟信号）,decoy（分子诱骗）,guide（蛋白引导）和scaffold（结构骨架）完成转录水平、转录后水平、表观遗传等方面重要功能。目前已有大量文献与研究证实lncRNA在胶质瘤、胶质母细胞瘤的发生发展中发挥重要功能。LncRNA由于其独特的机制和功能日益受到关注,靶向lncRNA的核酸药物设计、肿瘤疫苗等正逐渐成为科学界关注的热点领域。基于上述背景,在本研究中,我们重点关注GBM代谢过程,针对胞内生成NAD+分子的重要来源MDH2,使用RNA免疫沉淀测序技术（RNA immunoprecipitation sequencing,RIP-Seq）和基因芯片鉴定分析与 MDH2 直接结合的长链非编码RNA,通过功能实验,依据其参与的分子生物学过程,鉴定并命名了一种名为苹果酸脱氢酶降解辅助性转录本（Malate Dehydrogenase Degradationhelper,MDHDH）的新型长链非编码 RNA。本研究揭示了 lncRNA MDHDH通过增强MDH2的降解在胶质母细胞瘤细胞中起到抑制作用,发现lncRNA MDHDH介导MDH2和蛋白酶体亚基PSMA1（蛋白酶体亚基α1）的相互作用,促进已经发生泛素化的MDH2通过蛋白酶体途径降解,从而抑制整体糖酵解水平和NAD+/NADH的比值,调节AMPK/mTOR通路,促进胶质母细胞瘤本身的过度自噬和细胞凋亡。本研究还证实了 lncRNA MDHDH 的上游机制:PRC2（Polycomb Repressive Complex 2,多梳蛋白复合物2）/EZH2（Enhancerof Zestehomolog 2,Zeste同源蛋白增强子2）诱导lncRNA MDHDH的表观遗传沉默并抑制其正常转录。基于该lncRNA的研究我们发现了一种“表观遗传-代谢-自噬”的潜在调控关系,LncRNAMDHDH可以视为泛素-蛋白酶体系统的新型分子伴侣,该lncRNA自身的下游效应影响了高速率糖酵解的维持,并可以有效逆转肿瘤细胞代谢重编程过程。同时也发现了 GSK126等药物对自噬通路的调节过程中的一种潜在的间接机制。为靶向EZH2药物应用、基于lncRNAMDHDH自身的分子伴侣功能的靶向性治疗等提供了具体的机制分析和科学证据。目的本研究具体内容包括以下四部分:第一部分:研究lncRNAMDHDH在胶质瘤（WHO分级Ⅰ-Ⅳ）的表达情况、流行病学特征、诊断效能和预后评价。第二部分:验证lncRNAMDHDH在多形性胶质母细胞瘤中的生物学功能与作用。第三部分:研究并验证lncRNA MDHDH发生相互作用的下游蛋白质、lncRNA与蛋白-蛋白相互作用的关系、在UPS系统中的发挥作用的环节、调控MDH2表达的分子机制、代谢表型改变和涉及的信号通路。同时设计回复实验验证lncRNAMDHDH发挥调控功能的依赖性机制。第四部分:研究影响lncRNAMDHDH表达的上游表观遗传学调控机制。方法第一部分:LncRNAMDHDH的鉴定以及在胶质母细胞瘤中作为生物标志物的表达特征、诊断效能、预后评价1.RNA免疫沉淀测序检测MDH2结合的lncRNA利用RNA免疫沉淀试剂盒获取MDH2结合RNA与蛋白质成分,RNA送检进行测序,选择鉴定特异性结合（表达差异大于2）的前十位lncRNA进行后续分析。2.鉴定检测lncRNAMDHDH在不同组织、细胞系中的表达水平比对基因芯片结果,筛选目标lncRNA,并使用qRT-PCR验证lncRNA在不同WHO病理学分级的组织、细胞系中的表达水平;根据lncRNA序列设计CISH探针孵育胶质瘤组织芯片,明确MDHDH在不同病理学分级胶质瘤组织中表达状态。3.lncRNAMDHDH的流行病学特征、诊断效能、预后评价利用TCGA数据库验证不同lncRNA MDHDH表达水平的患者的生存预后差异;验证lncRNAMDHDH母本与临床病理特征的相关性,利用单因素与多因素Cox回归分析验证其对于各类生存预后事件的影响。第二部分:LncRNAMDHDH对胶质母细胞瘤的抑制作用1.建立过表达/敲低lncRNA MDHDH的胶质瘤细胞模型构建过表达与敲低lncRNAMDHDH的胶质瘤细胞模型。同时构建稳定转染细胞用于体内实验。2.研究lncRNA MDHDH在不同表达条件下对细胞一般表型（增殖、迁移与细胞活性）的影响。利用CCK8EdU掺入实验检测lncRNAMDHDH对细胞增殖与细胞活性的影响。Transwell小室通过被覆或不被覆基质胶观察lncRNA MDHDH对细胞侵袭与迁移能力的影响。划痕实验观察lncRNAMDHDH对细胞运动能力的影响。使用GL261细胞系进行原位体内成瘤实验,利用生物发光观察肿瘤体积变化、统计不同组别实验动物生存时间。利用上述体内、体外实验验证lncRNAMDHDH影响胶质母细胞瘤的恶性表型。第三部分:LncRNAMDHDH促进MDH2降解、调控NAD+代谢和调控细胞自噬的分子机制1.筛选lncRNA MDHDH其他互作蛋白并验证lncRNA MDHDH与MDH2和PSMA1的相互作用体外转录lncRNA MDHDH全长,构建生物素标记lncRNA MDHDH探针进行RNA pull-down和质谱实验,获取相互作用蛋白,利用MCODE与通路富集研究lncRNAMDHDH发生功能作用的主要通路。并通过RNA pull-down的蛋白样品进行Western blot验证,明确发生交互作用的蛋白。RIP实验反向验证目的蛋白与lncRNAMDHDH的交互作用,明确lncRNAMDHDH与MDH2与PSMA1的相互作用。验证lncRNA MDHDH对MDH2在基因与蛋白层面表达的影响。2.验证lncRNAMDHDH与蛋白结合区域以及对蛋白-蛋白相互作用的影响根据lncRNA二级结构与序列比对结果,构建截短体质粒,分别体外转录并生物素修饰,重复RNA pull-down实验,明确lncRNA与蛋白结合部位。免疫荧光处理后验证lncRNAMDHDH促进MDH2与PSMA1共定位。3.研究lncRNAMDHDH对MDH2降解的影响核浆分离实验,分别提取核蛋白裂解液、胞浆裂解液、总细胞裂解液,Western blot验证lncRNA MDHDH对交互蛋白的定位改变的作用。CHX与MG132处理细胞,研究MDH2在不同lncRNA MDHDH表达状态下的降解曲线,以及对泛素化水平的影响。使用MDH2抗体进行免疫沉淀,沉淀不同lncRNA MDHDH表达水平细胞模型的总MDH2,使用泛素抗体进行Western blot验证,明确lncRNA MDHDH作用环节。使用MDH2\PSMA1抗体进行免疫共沉淀,研究不同lncRNAMDHDH表达状态下的MDH2与PSMA1相互作用的变化情况。4.研究lncRNAMDHDH导致的MDH2降解对代谢相关表型的影响过表达lncRNAMDHDH后验证对细胞总乳酸、总丙酮酸影响,评估其对细胞能量代谢的调节功能。JC-1探针孵育细胞后研究对线粒体自由能变化的影响。检测不同lncRNAMDHDH表达水平细胞模型的OCR（O2 consumption rate,OCR,氧摄取率/耗氧率）,ECAR（Extracellular acidification rate,ECAR,胞外酸化率）,评估细胞的线粒体功能和代谢状况。检测不同lncRNAMDHDH表达水平细胞模型的NAD+与NAD+/NADH比率改变。腺病毒感染细胞表达Ad-mCherry-GFP-LC3B融合蛋白,观察不同lncRNA MDHDH表达水平自噬流变化情况。Western blot检测能量代谢-自噬相关通路AMPK/mTOR改变情况,以及自噬标志物变化情况。5.构建PSMA1敲低细胞系模型（siPSMA1）,设计回复实验,验证调控过程中PSMA1的功能必要性以 PSMA1 为靶点设计小干扰 RNA（Small interfering RNA,siRNA）siPSMA1,使用该siRNA转染胶质瘤细胞系并进行qRT-PCR验证敲低效率,构建PSMA1低表达胶质瘤细胞模型。使用过表达lncRNA MDHDH的同时敲低PSMA1后（OE lncRNA MDHDH+siPSMA1）的细胞模型,检测代谢表型:NAD+与NAD+/NADH、线粒体自由能、OCR/ECAR、自噬流、Western blot检测能量代谢-自噬相关通路AMPK/mTOR改变回复情况,以及自噬标志物变化回复情况。同时评估对胶质瘤细胞增殖（Edu法）、迁移（Transwell法及划痕实验）、细胞活性（CCK-8法）表型的回复情况。体内实验使用过表达lncRNA MDHDH的同时利用慢病毒shRNA载体敲低PSMA1后（OE lncRNAMDHDH+shPSMA1）的细胞进行裸鼠原位成瘤,生物发光对比肿瘤体积变化情况。平行批次同时使用OE lncRNA MDHDH+shPSMA1制备的原位成瘤肿瘤标本进行HE染色评估浸润剂体积增长情况、IHC染色评估lncRNA对细胞增殖标志物（Ki67）以及靶向苹果酸脱氢酶2（MDH2）的表达影响。第四部分:LncRNA MDHDH的上游表观遗传学调控机制1.影响lncRNA MDHDH表达的表观遗传学因素利用cisDB数据库寻找影响lncRNAMDHDH表达的表观遗传学修饰,并利用CGGA数据库验证EZH2与lncRNA MDHDH母本的表达关系。2.验证GSK126对lncRNAMDHDH的表达恢复使用EZH2抑制剂GSK126处理细胞,验证总体表观遗传学水平变化;ChIP-PCR 验证表达 lncRNA MDHDH 表达,qRT-PCR 验证 lncRNA MDHDH 表达变化。结果第一部分:LncRNA MDHDH的鉴定以及在胶质母细胞瘤中作为生物标志物的表达特征、诊断效能、预后评价基于MDH2的RNA免疫沉淀结果结合前期临床标本筛选结果,我们鉴定出了新的长链非编码RNA转录本NR028345与MDH2结合并具有“正常组织-瘤旁组织-肿瘤”逐渐减少的表达趋势,结合胶质母细胞瘤组织水平、细胞水平的表达验证明确了这一结论。并通过生物信息学方法、和组织芯片CISH染色进行了验证,通过FISH的方法明确了其定位在细胞浆中。临床应用方面使用TCGA-LGG/GBM数据集对其生存预后的价值进行了验证,并使用TCGA的临床数据针对不同临床预后结局对lncRNA MDHDH进行了评价,使用ROC曲线法对诊断价值进行了评价,同时应用收集的临床病例进行了验证。LncRNA MDHDH在TCGA的胶质瘤数据集中高表达预后更佳,具有良好的诊断效能,Cox回归显示其为保护性因素。第二部分:LncRNA MDHDH对胶质母细胞瘤的抑制作用根据第一部分的实验结论,我们使用过表达/敲低lncRNA MDHDH的方法,验证其对胶质母细胞瘤一般恶性表型的影响,结果显示过表达lncRNAMDHDH导致胶质母细胞瘤细胞系活力降低、增殖减弱、细胞运动能力减退以及侵袭与迁移能力的下降。体内实验肿瘤体积减小,实验动物生存延长。敲低lncRNA MDHDH后胶质母细胞瘤的一般恶性表型的改变为阴性结果,可能与过低的基础表达量有关。第三部分:LncRNA MDHDH促进MDH2降解、调控NAD+代谢和调控细胞自噬的分子机制我们使用lncRNAMDHDH体外转录并生物素修饰制备RNA探针进行RNA pull-down试验,质谱分析鉴定了与lncRNA MDHDH结合的蛋白质。我们应用生物信息学手段对蛋白质列表进行了通路富集分析发现富集蛋白主要与代谢密切相关。过表达后我们发现lncRNA MDHDH影响了蛋白质水平的MDH2的表达,但不影响MDH2的mRNA水平表达,我们据此判断lncRNA MDHDH在转录后水平调控MDH2,并结合质谱实验结果我们鉴定发现PSMA1同样与lncRNA MDHDH结合,且在过表达的情况下lncRNA MDHDH促进了 MDH2和PSMA1的结合。针对降解途径我们发现lncRNA MDHDH轻微促进了 PSMA1的定位由细胞核转向细胞浆,且影响了 MDH2的降解速度,蛋白酶体抑制实验发现当应用MG132（蛋白酶体抑制剂）后MDH2的表达量出现了恢复,且发现过表达lncRNA MDHDH后总体泛素化水平降低。应用MDH2的免疫沉淀技术富集纯化MDH2蛋白,并使用泛素抗体进行半定量分析,我们发现lncRNAMDHDH不影响MDH2的泛素化修饰。随后我们使用两种胶质母细胞瘤细胞系对PSMA1和MDH2的免疫共沉淀进行了分析,发现lncRNA MDHDH促进了 MDH2和PSMA1的结合。最终,使用融合蛋白质粒（Flag-MDH2,His-PSMA1）和工具细胞系HEK293T对表达融合蛋白的细胞裂解液进行免疫沉淀富集和纯化,并应用纯化后的融合蛋白进行RNA pull-down验证,证实lncRNAMDHDH均与二者存在结合,排除了其他细胞组分的影响。代谢表型方面结果显示过表达组总体乳酸丙酮酸水平降低,NAD+和NAD+/NADH 比值降低,ECAR与OCR得到相近的结果,细胞总体摄氧量减低并总体糖酵解水平（ECAR）下降,同时自噬流的mCherry-GFP-LC3B标记物荧光显微镜下显示大量自噬体形成,验证了 MDH2蛋白水平降低导致NAD+/NADH 比例下降,糖酵解水平降低并诱导异常自噬凋亡的实验假设。回复实验方面,由于MDH2结合lncRNAMDHDH需要通过PSMA1发挥具体的降解功能,lncRNA MDHDH的功能可能具有PSMA1依赖性,为验证这一假设设计回复实验,应用PSMA1的siRNA和慢病毒shRNA载体构建瞬时转染和稳定转染体系。在过表达lncRNA MDHDH的同时敲低PSMA1进行表型验证。结果显示在敲低PSMA1后,胶质母细胞瘤细胞系的代谢表型均有不同程度的恢复,其中以自噬流的回复最为明显。体内动物实验的回复实验中,过表达lncRNA MDHDH并敲低的细胞种植成瘤体积接近阴性对照水平。同时HE染色和IHC染色的结果显示回复实验组的细胞密度、肿瘤体积均回复,且过表达组中能观察到的增值指标（Ki67）减弱和MDH2阳性减弱的现象也得到了回复,验证了 lncRNAMDHDH发挥MDH2降解的过程中存在PSMA1的依赖性。第四部分:LncRNA MDHDH的上游表观遗传学调控机制使用生物信息学手段分析了 lncRNAMDHDH在其自身转录起始位点存在异常的H3K27me3修饰。参考其他研究使用GSK126这一 EZH2抑制剂开展上游研究。结果显示EZH2和lncRNAMDHDH的母本存在表达的负相关性,同时应用GSK126后可以在胶质母细胞瘤细胞系中观察到明显的总细胞水平的H3K27me3水平的降低,同时应用GSK126后进行染色质免疫沉淀,使用H3K27me3抗体进行ChIP实验,并使用TSS区域设计引物进行PCR验证,证实应用GSK126后的TSS区域H3K27me3富集减弱。应用GSK126的3天后即可以观察到有效的表达恢复。结论本研究鉴定并验证了在胶质母细胞瘤中的新型lncRNA MDHDH由于EZH2/PRC2导致的表观遗传学沉默。LncRNA MDHDH通过介导泛素化后的MDH2与蛋白酶体亚基PSMA1的结合促进MDH2的降解,从而降低胶质母细胞瘤细胞的NAD+/NADH比值,影响细胞供能并通过AMPK/mTOR通路诱导自噬,从而发挥肿瘤抑制功能。这一研究为蛋白酶体抑制剂类、BRD4/EZH2抑制剂类药物的应用提供了科学证据,LncRNAMDHDH的表达恢复可能是此类药物的一种下游机制,而蛋白酶体抑制剂类的应用应考虑患者的性别以及基础lncRNA MDHDH表达水平等因素。同时lncRNA MDHDH作为胶质瘤的新型生物标志物,可以有效帮助判断预后和进行疾病诊断。本研究发现了一条相对完整的“表观遗传-代谢-自噬”的调控链路,靶向lncRNA MDHDH的过表达可能是一种新的协同策略,用于增强基于代谢、基于表观遗传学和基于自噬调节的疗法,从而实现其对多形性胶质母细胞瘤患者的临床获益。