【目的】本试验通过在体外添加不同生长因子,拟探索稳定高效的体外诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛β细胞的诱导体系,为进一步进行深入研究及临床实践中应用干细胞移植治疗糖尿病奠定试验基础及临床指导意义。【方法】分别采用全骨髓贴壁法和红细胞裂解法体外分离获取兔骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),倒置显微镜观察细胞形态、采用台盼蓝染色法检测细胞活性、记录两种分离方法首次达到传代的时间、细胞免疫组化法鉴定CD90、CD44、CD34表面抗原的表达;分别在原代培养12 h、24 h、48 h、72 h时首次换液,以后每3 d换液一次,记录各组各代培养时间及培养总周期,筛选出最佳首次换液时间;取生长良好的P3代细胞,采用添加体外生长因子三步法,分阶段将兔BMSCs体外诱导为胰岛细胞,第一阶段用含有10ng/mLbFGF、1%DMSO、1%FBS、23 mmol/LGlucose的H-DMEM培养液对BMSCs诱导3d,第二阶段用含有10 ng/mLbFGF、10 ng/mLEGF、2%B27、10 mmol/L尼克酰胺、17.5mmol/LGlucose的无血清DMEM/F-12培养液对BMSCs诱导8 d,第三阶段用含有10mmol/LHEPES、10 mmol/L尼克酰胺,2 nmol/L的activin-A,11.1 mmol/LGlucose的RPMI1640培养液对兔BMSCs诱导8 d,倒置显微镜下观察其形态学变化;双硫腙染色鉴定细胞团;胰岛细胞特异性基因(Pdx-1、Insulin、Nkx6.1)的表达用RT-PCR方法检测;免疫细胞化学法检测特异性蛋白(胰岛素蛋白)的表达;ELISA检测胰岛素分泌的情况。【结果】两种分离方法均能获得较均一的长梭形细胞,所培养细胞CD90、CD44抗原阳性表达,CD34抗原阴性表达。其中红细胞裂解法所得细胞活性较全骨髓贴壁法高,首次传代时间短,差异显著(P<0.05);24h首次换液各代达传代时间所需时间与其他各组比较差异极显著(P<0.01),为最佳首次换液时间,可显著缩短细胞培养周期;第一阶段诱导末(3 d),细胞形态无明显变化,部分细胞变圆,双硫腙染色不着色,RT-PCR未检测到任何特异性基因的表达;诱导第7 d时,细胞逐渐融合,细胞簇增多,直径变大,双硫腙染色细胞团呈棕红色,仅检测到PDX-1基因的表达,证实其为胰岛前体细胞;第二阶段诱导末(11 d),细胞簇数目增多,细胞边缘突起,检测到PDX-1、Insulin的表达;第三阶段诱导末,细胞团状物与周围组织分离,形成类胰岛样结构,双硫腙染色细胞呈红棕色,PDX-1、Insulin、Nkx6.1基因均表达;免疫细胞化学法检测细胞内胰岛素蛋白的表达,试验组细胞胞浆内出现大量棕黄色颗粒,结果呈阳性反应,对照组细胞胞浆内未出现棕黄色颗粒,结果呈阴性反应;诱导3、7、11、15、19 d的胰岛素分泌量分别为(27.86±0.034μIU/mL)、(29.33±0.48μIU/mL)、(29.92±0.46μIU/mL)、(31.32±0.03μIU/mL),与对照组(20.54±0.21μIU/mL)、(22.10±0.45μIU/mL)、(22.36±0.35μIU/mL)、(23.39±0.20μIU/mL),3 d时诱导组与对照组相比差异不显著,因为此时未出现细胞团样变化,未分泌胰岛素,7 d、11 d、19 d差异均显著(P<0.05)。【结论】采用红细胞裂解液法,24h首次换液能够明显缩短骨髓间充质干细胞的培养周期,所得细胞生长增值能力强、纯度高、生物学特性稳定,具有多向分化能力;在体外采用生长因子三阶段诱导法,能够诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成熟的具有功能性的胰岛β细胞。