前言 1955年Melrose应用心脏停搏液进行心肌保护，发展至今，心肌保护领域理论已在临床整体水平、亚细胞水平及分子水平获得全方位的突破。体外循环心内直视手术的心肌保护是多方面的，简单概括为”慎于术前，严于术中，善于术后”。术前心肌保护工作主要为改善心功能，增加心肌能量贮备；术中主要是降低心肌氧耗，减轻或预防心肌缺血再灌注损伤；术后保证冠状动脉血供，控制心脏前后负荷，促进心肌顺应性的恢复。这其中关键是升主动脉阻断后的心肌保护，而心肌保护液成分改进则是临床心肌保护研究的重要内容。研究发现，阻断循环时心肌即使得到了保护，但恢复灌注时，再灌注却会反常地造成损伤的加重。表现为心肌水肿，氧和基质利用能力下降，高能磷酸盐和糖原减少或耗尽，细胞内大量钙盐沉积，线粒体严重受损，以及心肌细胞收缩功能减弱和心室顺应性改变。因为此现象出现在恢复血液循环后数分钟，故称为心肌缺血再灌注损伤(MIRI)。 现已证明，中性粒细胞和氧自由基是造成MIRI的重要因素。冠状血管内皮损伤是心肌缺血再灌注损伤发生、发展中的一个重要环节，同时，其本身是缺血再灌注后氧自由基的初始来源之一。中性粒细胞被氧自由基、细胞因子、炎性介质激活，粘附于血管内皮表面，进而大量产生氧自由基，攻击心肌细胞、血管内皮细胞，同时形成微栓，阻塞微循环，导致恢复血液灌注的心肌再度缺血、损伤、坏死。因此心肌保护的概念已从单纯保护心肌延伸到紧密相关的血管内皮功能的保护。同时，随着分子生物学理论和技术的发展，人们逐步发现，缺血再灌注损伤病理变化的核心是基因表达及其调控问题。参与这些基因调节的重要成份是由核因子-κB(NF-κB)和κB抑制性蛋白(I-κB)组成的复合物。NF-κB调节多种即早基因表达，参与免疫、炎症和细胞防御等反应。但不适当的激活又可引起过度炎症反应和损伤，所以，调节NF-κB活性无疑将会有助于防治心肌缺血再灌注损伤。 1987年Palmer等首次证明了内皮衍生性血管舒张因子的主要活性成分是一氧化氮(NO)。在心血管系统，NO被认为具有扩张血管、抑制血小板与中性粒细胞粘附、聚集、激活的功能。正是在这一背景下，当前为防治围术期MIRI损伤，进行心肌保护的策略已经集中到左旋精氨酸一氧化氮(L一A嗯一NO)的合成通路上。四氢生物蝶岭(BH4)是一氧化氮合酶(NOs)的重要辅助因子，因而，内源性NO的生成量严格依赖适当的BH4水平。BH4水平的减少可导致NOS功能失调，产生过量的氧自由基而代替NO的产生。心肌的缺血再灌注损伤可引起内源性BH4量减少，导致内皮和心肌细胞功能降低。 本实验旨在:(l)通过建立成年和幼年大鼠离体全心缺血再灌注动物模型，测定外源性补充BH4对心肌缺血再灌注过程中不同时点的NOS活性、NO产量、脂质过氧化物及心肌细胞ATP酶的影响以及缺血再灌注后冠状动脉流量恢复和心肌酶学的影响，判定BH4在成熟和未成熟心肌缺血再灌注损伤中的作用。(2)检测BH4对全心缺血再灌注动物模型中TNF-a基因表达，心肌组织内核因子一KB活性变化与细胞间粘附分子一1含量的影响。初步探讨BH4对心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制，为心脏手术心肌保护策略提供新的细胞靶点。材料和方法 1.实验动物:雄性成熟Wistar大鼠，体重220一3009，so只;健康Wistar幼鼠，3一4周，雌雄不拘，体重50一709，so只。将成鼠和幼鼠分别随机分为实验组和对照组，每组40只。 2.主要仪器:Keeler 2 .5倍显微外科手术放大镜，英国K吮ler公司;SSW一型显微外科手术器械，上海手术器械厂;自制肠邢endo进离体心脏灌注装置;UP 200H型超声匀浆机，德国;500一P紫外光可见光连续分光光度计，法国; FORMA一25型深低温冷冻冰箱，美国;TECAN sUNR巧E型酶标仪，奥地利;BCoo光学显微镜，台湾;SHANDON Tbenno型全自动切片机，英国;PTC一looPCR扩增仪，美国;Kodakm型凝胶成像系统分析仪，美国;ERMLE乃83K低温高速离心机，德国。 3.主要实验试剂:四氢生物蝶岭，美国sigma公司;N。试剂盒、Nos测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、肌酸激酶(CK)试荆盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、MDA测定试剂盒、soD测定试剂盒、ATP酶测试盒，均购自南京建成生物工程研究所;NF一KB巧5原位杂交检测试剂盒和NF一KB巧5免疫组化检测试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司;TNF一a PCR检测试剂盒，大连TaKaRa宝生物工程有限公司;TNF一a PcR引物，北京华美生物工程公司;大鼠sICAM一l定量ELIsA试剂盒，上海森雄科技实业有限公司。 4.离体心脏灌注模型的制备:实验动物腹腔注射10%乌拉坦(10xnl/kg)麻醉，腹腔注射肝素钠抗凝:成鼠sooU，幼鼠looU。开胸迅速取出心脏，并立即浸人4℃冷生理盐水中，经主动脉插管后，连接于Ungendo进灌注装置上，以37℃K一H液逆行灌注，灌注压恒定为70~Hg。经巧而n的自然灌流平衡后，实验组及对照组分别用4℃含BH4 st.Tho~11，心脏停搏液(20卿oFL)及st.Th。~n心脏停搏液进行停搏。心脏缺血30而n后，以37℃K一H液再灌注120而n。分别留取缺血前、缺血