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目的:首先研究了 PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路在下咽癌发生发展中的作用,进而探讨两条通路的抑制剂GDC-0980和Refametinib单独与联合用药对下咽癌细胞的抑制作用及分子机理,为PI3K与MAPK抑制剂类新型抗下咽癌药物的开发及应用提供理论依据和初步实验基础。另外,本文分析了嗅神经母细胞瘤临床病例特点,并检测了 PI3K/Akt以及MAPK/ERK信号通路中关键因子Akt、Erk、Stat3和Stat5的磷酸化水平,为阐明嗅神经母细胞瘤的发病机制提供实验基础。方法:1.应用免疫组化方法观察下咽癌组织及癌旁正常组织中Akt和Erk的磷酸化水平,并分析了两者之间、以及两者与下咽癌患者临床病理因素之间的相关性。2.采用MTT实验研究了抑制剂GDC-0980和Refametinib对下咽癌FaDu细胞增殖的影响;利用PI染色法结合流式细胞术分析GDC-0980和Refametinib对FaDu细胞周期的影响;采用Annexin-V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测两药诱导凋亡作用;利用Western blot方法检测两药对FaDu细胞周期相关蛋白以及PI3K/Akt和MAPK/ERK通路相关蛋白表达或磷酸化的影响;采用qRT-PCR法研究了两药对p27 mRNA表达水平的影响;通过划痕实验和Transwell实验评估两药对FaDu细胞迁移能力的影响。3.采用 Chou-Talalay 法结合 CalcuSyn 软件分析 GDC-0980 和 Refametinib联合用药对细胞增殖的抑制活性,从而评价药物联用效果;采用软琼脂克隆形成实验评估药物进一步验证协同作用,通过PI染色结合流式细胞术分析联合用药对细胞周期的影响,使用Western blot方法和Real-time定量PCR分析联合用药对细胞周期相关蛋白及p27 mRNA表达水平影响,最后,利用Western blot法研究联合用药对PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路中Akt、mTOR及Erk磷酸化水平的影响。4.回顾性分析2007年9月-2015年8月收治的10例嗅神经母细胞瘤患者的临床资料。应用免疫组化方法观察嗅神经母细胞瘤组织中Akt、Erk,Stat3和Stat5的磷酸化水平,分析PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路与该肿瘤发生发展的关系。结果:1.Akt和Erk在下咽癌组织中的磷酸化水平明显高于癌旁正常组织;癌组织中两种分子的磷酸化水平之间无显著相关性;在下咽癌组织中,Akt和Erk蛋白的磷酸化水平与年龄、性别、病理组织分化无关;不同的是,p-Akt在淋巴转移组和非转移组之间无显著性差异,而Ⅲ、Ⅳ期的p-Akt明显高于Ⅰ,Ⅱ期,T3,T4期明显高于T1,T2期;p-Erk水平在不同的T分期无明显统计学差异,Ⅲ,Ⅳ期明显高于Ⅰ,Ⅱ期,淋巴转移组的p-Erk明显高于无淋巴结转移组,存在显著性差异。2.GDC-0980和Refametinib均以剂量依赖性的方式抑制FaDu细胞的增殖;GDC-0980和Refametinib处理过的FaDu细胞均出现了 G1期阻滞,但无明显的诱导FaDu细胞凋亡的现象。周期调控蛋白cyclinD1和p-pRb的水平降低,p27在蛋白和RNA水平的表达增高;GDC-0980作用于FaDu细胞后,PI3K/Akt通路中PDK1,Akt,mTOR和p70 S6K的磷酸化水平呈剂量依赖性下降;Refametinib作用于FaDu细胞后,MAPK/ERK通路中Erk的磷酸化水平显著下降,而Erk的表达无明显变化。GDC-0980具有抑制FaDu细胞的迁移能力,Refametinib抑制细胞迁移效果不明显。3.GDC-0980和Refametinib联合用药比各自单独用药对FaDu细胞增殖的抑制效果更强,2×IC50 GDC:IC50 Refa在所设定的三种联用中抗肿瘤协同作用最佳;软琼脂克隆形成实验进一步证实,联合用药更显著地抑制FaDu细胞克隆形成。两药联用使FaDu细胞周期停滞于G1期,cyclinD1的表达和pRb的磷酸化水平降低,而p27蛋白和mRNA表达增高,并且联合用药后FaDu细胞中Akt,mTOR和Erk磷酸化水平降低。4.10例嗅神经膜细胞瘤患者中,6例为T3,T4期,6例为Kadish分期的C,D期,3例为Hyams分级的Ⅲ级,这些较为晚期的患者往往预后不好。P-Akt,p-Erk,p-Stat3和p-Stat5阳性例数分别是5(50%),9(90%),7(70%)和0 例(0%)。结论:1.PI3K/Akt及MAPK/ERK通路可能在下咽癌发生发展中发挥重要作用,PI3K/mTOR抑制剂GDC-0980和MEK抑制剂Refametinib可以明显抑制下咽癌细胞增殖,并引起细胞周期G1期阻滞,该作用可能是通过调控PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路实现的,两药的联合应用在下咽癌细胞中显示出较强的协同抗肿瘤作用。2.Akt,Erk,Stat3的磷酸化水平在嗅神经母细胞瘤较高,提示PI3K/Akt以及MAPK/ERK信号通路在其发病和疾病进展中可能发挥重要作用。