水稻白叶枯病(rice bacterial blight)是水稻生产中主要的病害之一,它是由水稻黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的一种细菌性病害。噻枯唑是我国目前用来防治水稻白叶枯病等细菌病害常用杀细菌剂之一,但噻枯唑存在活体与离体活性差异,其防治白叶枯病的作用机制还尚未清楚。本论文围绕上述目的进行了以下研究:(1)噻枯唑的光解特性和光解产物及其抑菌活性研究;(2)噻枯唑及同系物噻唑锌对水稻防卫反应诱导作用及机制;(3)噻枯唑对Xoo致病力的抑制作用及机制;(4)水稻上表现噻枯唑抗性菌株2-1-1的遗传基因变异。1.噻枯唑的光解特性和光解产物及其抑菌活性研究陈锡岭等(1993)发现噻枯唑在水中和水稻上均存在光解作用,但其光解路径和光解产物知之甚少,尤其是探明光解产物的生物活性是揭示噻枯唑防治水稻白叶枯病作用机制需要解答的科学问题之一。我们分别在自然光和光解箱条件下对噻枯唑进行光解,光解溶液中生成黄色颗粒状物质,经溶解性和化学检测证明是硫单质。噻枯唑自然光条件下光解6天和光解箱条件下8小时的溶液对Xoo活体和离体抑制活性显著强于未光解的溶液,说明光解作用能够显著增强噻枯唑对Xoo的抑制活性。我们利用液质联用技术对比了噻枯唑未光解、光解4h和8h的液相图谱,找到了噻枯唑的三种光解中间产物和三种光解最终产物,质谱鉴定出这六种光解产物的分子量,结合化学知识分析出了它们的化学结构式。其中光解产物PP1和PP2的保留时间为2.23 min和3.32min,鉴定为敌枯双和敌枯唑。它们对动物和人体有毒副作用,所以噻枯唑在运输和储存中需要避光。光解产物PP3的保留时间为1.81 min,之前未被研究,但Li等(2015)报道1,3,4-噻二唑的砜类衍生物对Xoo和Xoc的抑制活性显著强于噻枯唑。作为一种1,3,4-噻二唑的砜类衍生物,PP3可能也对这两种细菌有很好的抑制效果。PP5的保留时间为5.95 min,是噻枯唑的光解中间产物,被鉴定为2-氨基-1,3,4-噻二唑。根据噻枯唑光解产物的结构式,我们推测出了噻枯唑可能的光解路径。另外我们通过生长抑制法测定比较了噻枯唑、2-氨基-1,3,4-噻二唑和敌枯唑对Xoo和Xoc的抑菌活性。基于EC50和MICs数值,噻枯唑和2-氨基-1,3,4-噻二唑在离体条件下对Xoo和Xoc的抑制活性强于敌枯唑,说明巯基结构在噻枯唑抑制细菌生长过程中起着重要的作用。Xoo 2-1-1对2-氨基-1,3,4-噻二唑表现活体抗性和离体敏感。实验结果表明噻枯唑和2-氨基-1,3,4-噻二唑对Xoo的活体和离体的作用相似,说明这两种噻二唑同系物防治水稻白叶枯病具有类似的作用机制。2.噻枯唑及其同系物噻唑锌对水稻防卫反应诱导作用及机制噻唑、异噻唑、噻二唑和它们的衍生物用于控制人类、动物和植物的各种病害,这些化合物除了有直接的杀菌效果,而且还可以诱导宿主的抗病性,但是关于这种诱导机制还有很多未知的领域。我们测定了 200 mgL-1噻枯唑和其同系物噻唑锌接种诱导水稻叶片的胞外H2O2含量和五个防卫反应相关基因(OsPR1a、OsPR1b、POX22.3、OsPAL和OsLOX)表达量的影响,发现单独噻枯唑和噻唑锌处理不能触发水稻H2O2释放和防卫相关基因的表达,说明噻枯唑和噻唑锌这两种噻二唑化合物处理水稻均无显著的诱导作用,但处理接种Xoo的水稻,能够导致水稻叶片内过氧化氢积累,防卫基因上调表达、胼胝质生成和接种处细胞过敏性坏死。药剂处理后用过氧化氢酶喷雾处理,水稻的上述防卫反应能够减轻或消除,H2O2是这两种噻二唑药剂诱导防卫反应过程中重要的传导信号和媒介。噻唑锌在接种Xoo一天后处理诱导水稻H2O2的产量和对Xoo的活体抑制率均强于接种一天前处理;当噻唑锌浓度从200 mg L-1提高到300mgL-1时,水稻的H202含量却显著下降。这些结果表明这两种噻二唑化合物的使用时间和浓度影响诱导水稻防卫反应的程度。用于防治水稻白叶枯病的药剂链霉素处理不能增强接种Xoo水稻的这种防卫反应,说明了这两种噻二唑药剂诱导作用具有特异性。由于胞外多糖是细菌生物膜所必须的组成部分,所以它是一种重要的致病因子,尤其针对于维管束病害,但还没有关于Xoo的胞外多糖在致病过程中发挥作用的报道。本研究用Xoo的胞外多糖喷雾处理能显著抑制水稻防卫基因的表达,提高水稻白叶枯病的形成和病斑扩展速度。胞外多糖合成基因gumH缺失突变体比亲本菌株ZJ173能更强烈地诱导水稻的防卫反应。这些结果表明,Xoo产生的胞外多糖可以显著抑制水稻的防卫反应,提高水稻对Xoo的敏感性。最近有很多报道称一些噻唑结构的化合物对细菌有抗生物膜形成的活性。本实验室马忠华等(1997)发现噻枯唑可以显著降低Xoo胞外多糖的产量。本研究进一步发现噻唑锌和噻枯唑较低剂量处理野生敏感型菌株Xoo ZJ173,能够显著降低Xoo的胞外多糖合成基因簇的表达量,显著抑制胞外多糖的生物合成。外源添加Xoo胞外多糖于培养基中并不影响这两种噻二唑药剂对Xoo的离体抑菌活性,但用Xoo的胞外多糖喷雾处理水稻对噻枯唑和噻唑锌的防卫反应诱导能力具有颉颃作用。另外,噻枯唑和噻唑锌处理对活体上表现抗药性的菌株2-1-1没有胞外多糖合成的抑制作用,对接种2-1-1菌株的水稻也没有防卫反应诱导作用。综上所述,我们发现噻枯唑及同系物噻唑锌可通过抑制Xoo胞外多糖生物合成降低水稻的脱敏反应,增强抗病性。3.噻枯唑对Xoo致病力的抑制作用及机制噻枯唑在离体下对Xoo生长的抑制活性并不高,但使用相对较低浓度的噻枯唑喷雾处理水稻对白叶枯病则具有良好的防治效果。30 mg L-1噻枯唑在离体环境中对Xoo分别处理4.5 h和9 h后,我们利用热图分析了噻枯唑处理样本中相比噻枯唑未处理样本2倍的差异基因,热图清晰地说明了噻枯唑处理4.5 h样本和噻枯唑未处理的样本之间显著差异,而且噻枯唑处理9 h样本的变化差异显著少于噻枯唑处理4.5 h样本。在噻枯唑处理4.5 h小时后,Xoo的217个基因显著上调,192个基因显著下调。在噻枯唑处理9h小时后,31个基因显著上调,19个基因显著下调。在实时定量PCR成功地验证RNA-Seq结果的可靠性之后,我们分析得到在噻枯唑处理4.5 h和处理9 h的样本差异基因中共有32个相同的基因,说明噻枯唑可以持续影响这些基因的表达。我们利用KEGG代谢途径分析了这32个共同的差异基因,发现其中6个差异基因(hutC、hutG、hutH、hutI、hutU和sdeB和是组氨酸代谢途径的主要基因,且表达量均被噻枯唑所抑制。实时定量PCR实验结果表明噻枯唑处理使得菌体在NB和XOM3的培养环境下的组氨酸代谢途径基因显著受到抑制,说明噻枯唑可以在离体和活体环境下均可抑制组氨酸代谢途径基因的表达。2-氨基-1,3,4-噻二唑也可以显著抑制组氨酸代谢途径基因的表达,但缺少巯基的敌枯唑和BTH却不具有此种特性,说明巯基在噻枯唑发挥功效的过程中起着重要的作用。为了研究组氨酸代谢途径基因如何影响Xoo,我们对比了△hutG和△hutU突变体和野生型ZJ173的多种表型。组氨酸代谢途径基因几乎不影响菌体生长和对噻枯唑的药敏性。但△hutG和△hutU突变体在生长后期聚集并形成可见的沉淀物,而野生型ZJ173和基因回复体菌液却处于分散状态。△hutG和△hutU基因缺失突变体比野生型ZJ173菌体细胞游动性更强、生物膜产量更低、致病力显著下降。该研究结果表明,组氨酸代谢途径与Xoo细菌群集感应有关并干扰其致病力。已有报道表明一些1,3,4-噻二唑衍生物对革兰氏阴性细菌拥有良好的抗群集反应能力。噻枯唑作为1,3,4-噻二唑衍生物,抑制Xoo的组氨酸代谢途径并干扰细菌的群集反应。在相同的抑菌活性条件下,噻枯唑可以增强ZJ173的游动性并降低生物膜产量,而链霉素和申嗪霉素不具有此种特性。另外,我们发现在噻枯唑处理4.5小时样本的差异基因中还有13个与群集反应相关的基因,这些基因控制细菌分泌扩散的信号小分子(small diffusible signal molecule,DSF)合成、胞外多糖合成、趋化性和胁迫反应。另外,噻枯唑对活体抗性菌株2-1-1的组氨酸代谢通路基因的表达、菌体群集感应和致病力则没有显著的抑制作用。综上所述,噻枯唑可以抑制Xoo组氨酸代谢途径和群集反应,降低菌体的致病力。4.噻枯唑抗性菌株2-1-1遗传基因变异的初步分析病原物的抗药性机制和药剂对病原物的作用机制紧密相关,我们可能通过研究病原物对药剂的抗性机制寻找药剂的特异性靶点。Xoo 2-1-1是野生型Xoo ZJ173接种喷施噻枯唑的水稻上筛选分离得到的对噻枯唑表现抗性的菌株,但2-1-1菌株在离体环境下表现对噻枯唑更加敏感。本文采用基因组重测序技术,对噻枯唑抗性菌株2-1-1进行了遗传变异机制的初步分析。通过构建350 bp小片段文库,利用HiSeq TM2000测序平台进行双末端测序,测序深度>100×。基因组数据表明,在水稻上表现噻枯唑抗性的2-1-1菌株和亲本野生型敏感菌株ZJ173均与标准菌株MAFF 311018亲缘性最高,基因组匹配率为99.37%。单核苷酸多态性分析发现2-1-1基因组相比较ZJ173基因组有多处基因点突变,我们利用PCR测序技术对这些点突变进行了验证,筛选出了含错义突变的Xoo 3738基因。为噻枯唑抗性机制研究奠定了较好基础。