油菜与核盘菌互作的组学解析

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油菜(Brassica napus)是我国主要的油料作物之一,由死体营养型病原真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)所致的油菜菌核病是对我国油菜生产危害最大的病害。但是,油菜抗菌核病资源缺乏,对油菜与核盘菌互作的机制研究还不够深入,抗核盘菌相关的调控因子亟待鉴定。因此,利用油菜基因组得到测定和解析的契机,本研究组合采用sRNA组、转录组、蛋白质组以及磷酸化蛋白质组等功能组学技术,对油菜与核盘菌互作机理进行组学解析,获得了以下主要结果:  (1)开展了油菜与核盘菌互作的miRNA组学分析,揭示了miRNA和AGO介导的RNA沉默对油菜与核盘菌互作的重要调控作用。通过高通量测序,鉴定得到油菜227个保守miRNA和53个新miRNA,并通过降解组测序鉴定了其中237个miRNA的靶基因。采用miRNA芯片分析鉴定获得68个响应核盘菌侵染的miRNAs,其中一组靶标植物防卫反应相关基因,包括NBS-LRR类抗病基因以及一氧化氮和活性氧相关基因。还有三个miRNA分别靶标RNA沉默核心基因AGO1和AGO2。瞬时表达RNA沉默抑制子减弱了植株对核盘菌的抗性。拟南芥ago1和ago2突变体植株对核盘菌更感而AGO1超表达植株则更抗。超表达靶标AGO1和AGO2的miRNAs的油菜植株对核盘菌的抗性显著减弱。  (2)从基因组水平鉴定了油菜RNA沉默核心组件基因家族—Dicer-like(DCL)、Argonaute(AGO)以及RNA-dependent RNA polymerase(RDR),首次揭示了Ca2+途径转录因子CAMTA3对RNA沉默的调控作用。油菜基因组含8个BnDCLs、27个BnA GOs以及16个BnRDRs基因,其中RDR5在油菜进化过程中得到了明显扩增。在总共51个油菜RNA沉默核心基因中有21个在其启动子区域含有结合CAMTA3的顺式作用元件CGCG box,凝胶阻滞分析证实其中15个能与BnCAMTA3蛋白CG-1结构域直接结合。核盘菌侵染强烈诱导BnCAMTA3表达的同时抑制了其中部分基因的表达。此外,一组拟南芥DCL、AGO及DR基因突变体包括dcl1-9、dcl4-2、ago9-1、rdr1-1、rdr6-1以及rdr6-15突变体显著改变了对核盘菌的抗性。这些结果进一步证明了RNA沉默机制对核盘菌抗性的重要调控功能,并揭示了CAMTA3对RNA沉默系统可能的新调控机制。  (3)开展了拟南芥ago2突变体和野生型植株响应核盘菌侵染的miRNA组和转录组关联分析,阐明了AGO2对核盘菌抗性的调控机制。分别获得了接种核盘菌前后的野生型以及ago2突变体植株的转录组和miRNA组,其中接种后的ago2突变体和野生型植株中差异表达miRNA和基因分别为32个和884个,组成了535对表达趋势相反的miRNA-靶基因关联对,其中包括16个靶标抗病相关基因的差异表达miRNA。其中靶标基因GSTU2、GSTU5以及RBOHF的拟南芥突变体植株对核盘菌更感。这些结果暗示AGO2可能通过调控miRNA和不通过调控miRNA的多种途径参与对核盘菌抗性的调控。  (4)基于定量蛋白质组学分析,鉴定了一批油莱抗核盘菌调控蛋白,揭示了新调控机制。基于TMT标记方法,利用Orbitrap组合式质谱仪,对接种野生型1980、不致病的Ep-1PB核盘菌菌株以及不接种的油菜叶片蛋白质组进行比较分析,在接种Ep-1PB与不接种、接种1980与不接种以及接种1980与Ep-1PB三个比较组中分别鉴定获得79、299以及173个差异表达蛋白。GO、KEGG以及蛋白互作分析表明,氧化还原平衡、脂信号途径、钙离子信号途径、组蛋白以及DNA甲基化介导的转录调控、defensin以及defensin-like等防卫相关蛋白以及氰化物裂解酶等在抗菌核病中起重要作用。  (5)开展了油菜响应核盘菌的定量磷酸化蛋白质组学分析,鉴定了一批油菜抗核盘菌相关磷酸化蛋白。利用磷酸化蛋白的TiO2富集技术结合非标定量方法,对接种野生型1980、不致病的Ep-1PB核盘菌菌株以及不接种的油菜叶片磷酸化蛋白质组进行比较分析,在接种Ep-1PB与不接种、接种1980与不接种以及接种1980与接种Ep-1PB三种比较组中分别鉴定获得2、11以及12个磷酸化差异蛋白。初步揭示了MED26c、TPR1、bZIP63等的磷酸化调控机制及其对油菜与核盘菌互作的调控功能。  综上,本研究对油菜与核盘菌互作机理开展了综合功能组学分析,揭示了RNA沉默等在油菜对核盘菌抗性中的重要调控作用和机制,并且鉴定了一批重要的抗病调控因子,揭示了油菜对核盘菌抗性的新调控机制。
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