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黄芪,“乃疮家之圣药”,具有补气而托毒生肌,利水消肿,益卫固表等功效。在临床上治疗气血不足,疮疡内陷的脓成不溃或溃久不敛的慢性伤口。在创伤愈合过程中细胞的增殖和胶原代谢失常起着至关重要的作用。创面内胶原合成能力降低和胶原分解过度,成为创面难愈合的重要原因。临床和动物实验均证明中药合理运用治疗慢性皮肤溃疡疗效显著。为研究黄芪对创伤愈合作用和其可能的机理,本论文以免疫抑制复合皮肤伤口（immunosuppressive and skin wound,ISW）模型和体外培养NIH3T3成纤维细胞为对象,观察内服黄芪水煎剂和外敷黄芪多糖（Astragalus Polysaccharin,APS）对创面的愈合作用;黄芪多糖和黄芪甲苷（AstragalosideⅣ）对细胞增殖和胶原代谢的调节作用,为中医外科治疗慢性愈合皮肤创面的治则、遣方用药提供科学实验依据。论文研究分为以下两部分进行:1整体实验1.1制备氢化可的松免疫抑制复合皮肤伤口的动物模型—虚寒性创面模型的探索本文首先制备免疫抑制复合皮肤伤口的动物模型。以氢化可的松处理小鼠造成免疫抑制状态,用特制打孔器打一均匀的圆孔,采取全层皮切除术,制作小鼠免疫抑制复合皮肤伤口。观察小鼠创伤前后一般情况并动态测定伤口面积愈合率。于创伤后3d、7d取伤口组织经HE和天狼猩红染色观察组织学变化。结果显示:（1）肌肉注射氢化可的松7天后,模型组小鼠一般情况较差,出现体重下降、毛色无光泽、萎靡不振、弓背少动、反应迟钝、并且有畏寒等现象。正常组小鼠一般情况良好,无以上症状。复合皮肤伤口后,模型组小鼠以上症状加重,眼睁不开,相互之间嘶咬,甚至少数死亡。（2）致创3天后,对照组与模型组伤口面积愈合率无明显差异,在致创7天时,模型组伤口面积明显大于对照组（P<0.05）,对照组伤口愈合率明显高于模型组。（3）镜下观察:创伤后第3d,HE染色观察对照组伤口有大量炎性细胞浸润,模型组小鼠创面炎症细胞较稀疏,天狼猩红染色对照组可见少量呈黄色的Ⅰ型胶原和呈绿色的Ⅲ型胶原,模型组Ⅲ型胶原要明显少于对照组;创伤后第7d, HE染色观察对照组周边炎性细胞浸润,有肉芽组织出现。对照组和模型组Ⅰ型和Ⅲ胶原均增多,模型组呈绿色的Ⅲ型胶原少于对照组。结果提示:注射氢化可的松后小鼠处于免疫抑制状态,皮肤损伤后仍处于免疫抑制状态,创面愈合延迟,属于虚寒性创面模型。1.2黄芪水煎剂对免疫抑制复合皮肤伤口小鼠创面的愈合作用本实验选取40只Bal/c小鼠,随机分为对照组、模型组、高剂量(293.12×10-3g/ mL)、中剂量(146.56×10-3g/mL)、低剂量(73.28×10-3g/mL)五组,在免疫抑制的基础上复合皮肤伤口,每隔2d测量小鼠的伤口面积,直至伤口愈合。结果表明,在造模当天致创后,统计分析各组创面面积愈合率无明显差异;创伤3天时,对照组和模型组的伤口愈合率之间统计学比较未见明显差异;在创伤6天时,对照组伤口面积愈合率明显大于模型组（P<0.01）。对照组的伤口面积要明显小于模型组,高剂量组与模型组比较（P<0.01）,中剂量组与模型组比较（P<0.05）,低剂量组与模型组比较（P<0.01）;创伤9天时,对照组与模型组比较（P<0.01）,中剂量组与模型组比较（P<0.01）;创伤12天时,高中低剂量组与模型组比较均（P<0.05）。镜下观察:对照组创面愈合时,模型组创面有炎性细胞浸润,黄芪水煎剂高剂量组、中剂量组、低剂量组创面可见新生毛细血管及成纤维细胞,和新生表皮形成,以高剂量尤为明显。1.3外用黄芪多糖对免疫抑制复合皮肤伤口小鼠创面的愈合作用本实验选取40只Balb/c小鼠,随机分为对照组、模型组、高剂量（0.8g/L）、中剂量（0.4g/L）、低剂量（0.2g/L）五组,每隔2d测量小鼠的伤口面积,直至伤口愈合。结果表明:在致创当天,统计分析各组创面面积无明显差异;创伤3天时,各组之间伤口愈合率比较没有明显差异;创伤6天时,对照组伤口面积愈合率明显大于模型组（P<0.05）,中剂量组与模型组之间比较（P<0.05）;创伤9天时,对照组与模型组之间比较（P<0.05）,中剂量组与模型组之间比较（P<0.05）;创伤12天后,对照组与模型组之间比较（P<0.05）,中剂量组与模型组之间比较（P<0.01）,高剂量组与模型组（P<0.05）。综上所述,创伤6d以后,对照组的伤口面积要明显小于模型组,愈合率要高于模型组,中级量组的愈合率要高于模型组,中剂量愈合速度最快,高剂量组在12d愈合率也高于模型组。可以得出外用黄芪多糖对Balb/c小鼠伤口愈合是具有促进作用的。HE染色时对照组创面愈合时有血管形成;模型组有少许炎性细胞浸润;黄芪多糖高剂量有炎性细胞浸润,能见角化层;中剂量愈合时,表皮结构已基本形成,有大量炎性细胞。2体外实验2.1 APS和黄芪甲苷对NIH3T3小鼠成纤维细胞增殖和迁移的影响本实验以NIH3T3为细胞模型,分为阳性药组、对照组、APS不同浓度组,每组10个复孔。作用48h后采用MTT法观察APS对NIH3T3小鼠成纤维细胞增殖的作用。黄芪多糖浓度在9.75μg/mL19.5μg/mL间对3T3小鼠成纤维细胞有明显的促增殖作用（P<0.01）,APS浓度在19.5μg/ml的增殖率达到颠峰,为23.06%;但APS大于156μg/mL对NIH3T3细胞有明显的抑制作用（P<0.001）。在作用24h,在19.5μg/mL-78μg/mL浓度范围内对3T3小鼠成纤维细胞有促增殖作用（P<0.05）,APS浓度在39μg/ml的增殖率作用最为明显,为27.06%,高浓度没有表现出抑制作用。作用72h,在所选的浓度范围内没有表现明显的增殖作用;但在312μg/ml,对细胞呈现明显的抑制作用,与对照组相比（P<0.001）。细胞迁移结果显示APS能促进较多的NIH3T3细胞进入细胞创口,分别与对照组有极显著差异（P<0.01）,bFGF组愈合速度最快,与同时相的APS组相比亦有极显著差异（P<0.01）。上述结果表明APS浓度对成纤维细胞的增殖有一定的量效关系,提示我们在临床上使用黄芪治疗慢性皮肤溃疡或慢性愈合皮肤创面用药时要注意药物的时间和剂量。2.2黄芪甲苷对NIH3T3小鼠成纤维细胞增殖作用本实验以NIH3T3为细胞模型,用MTT法检测加药48h时,黄芪甲苷对3T3成纤维细胞增殖在浓度为20μg/mL和10μg/mL时,黄芪甲苷组的OD值均高于相对应的DMSO对照组,但是之间没有显著性差异。作用72h时,在浓度为20μg/mL时,黄芪甲苷组的OD值明显高于对应的DMSO对照组（P<0.05）,在浓度为10μg/mL和5μg/mL时,黄芪甲苷组的OD值均高于相对应的DMSO对照组。综合48h和72h的结果来看,时间延长黄芪甲苷对3T3增殖有加强的趋势,随着浓度增加增殖作用在增强。2.3黄芪多糖和黄芪甲苷对胶原合成的影响本实验以NIH3T3为细胞模型,用羟脯氨酸试剂盒测量黄芪多糖对NIH3T3细胞胶原合成作用的影响。加药48小时,2.44μg/mL～9.75μg/mL浓度范围内对胶原蛋白合成具有促进作用,与细胞对照组比较差异显著（P<0.05）。黄芪甲苷对3T3细胞胶原合成的浓度效应在浓度为20μg/mL时,黄芪甲苷组的OD值高于相对应的DMSO对照组（P<0.05）。在浓度为10μg/mL和5μg/mL时,黄芪甲苷组的OD值高于对应的DMSO对照组,但运用统计学分析之间没有显著差异。综合上述结果可以得知黄芪甲苷影响3T3细胞胶原合成。本论文是首先制备小鼠免疫抑制复合皮肤伤口的动物模型,并在此基础上进行实验研究。实验结果提示:免疫抑制复合皮肤伤口模型符合虚寒性创面模型。内服黄芪水煎剂能加速创面的愈合,其机理是提高了小鼠正气和免疫力。外敷黄芪多糖也能加快创面的愈合,其机制可能是通过改善创面的物理化学状态,改变创面的渗透压,调节局部炎症因子水平,增加局部巨噬细胞数量,从而加快伤口的愈合。细胞实验结果显示:黄芪多糖在一定的浓度范围内可促进成纤维细胞的增殖和胶原的合成,增强创伤基质的合成以促进伤口愈合。