1研究背景与研究目的肝母细胞瘤患者的生存率都随着其分期的升高而下降,目前常用的诊断、判断预后的血清标志物是甲胎蛋白,但在多种疾病及正常新生儿、小婴儿中均升高,特异性较低。由此可见,利用现有的实验技术寻找一种高特异性、高敏感性的肝母细胞瘤早期检测方法迫在眉睫。蛋白质组学在肿瘤中的研究可以用于疾病早期诊断、疗效监测和预后判断等方面。目前,已有成功检测出肾母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌等癌症的生物学标记物。本研究组前期应用蛋白质组学对肾母细胞瘤血清、瘤体组织进行了深入的研究,研究得出的生物学标记物目前已进入动物实验阶段,试验结果初步表明蛋白质组学可筛选、鉴定出可靠的高特异性、高敏感性标记物;本实验室前期蛋白质组学已初筛出肝母细胞瘤的血清生物标记物,本研究进一步细化分组,深入研究,验证前期试验结果,并对该标记物在不同分期、不同手术方式、不同诊疗阶段患者的血清学生物表达,进一步研究该标记物与肝母细胞瘤的关系及对肿瘤的影响。2材料与方法2.1实验材料肝母细胞瘤患者血清样本294例份,健康对照组血清80例份。分为术前组(根据pre-text分期:I期10例,II期17,III期38例、IV期15例)、术后组、化疗组、治愈组、复发组。取材条件:晨起、空腹、外周静脉血5ml,4℃下静置1h,3000r/min离心15min,取上清液。所有病理结果均经过两次病理学检验无误。2.2.1肝母细胞瘤血清蛋白质标记物的筛选及其表达强度对比血清标本在冰(水)浴上缓慢融解,离心,加样、混匀血清样本与U9处理液;混匀期间将蛋白质芯片装入96孔蛋白质芯片工作支架Bio-processor中,记录芯片编号;每孔中加入Na AC(100mmol/L,p H=4)200μl,置入曾析柜振荡平衡(600rpm,室温,5min),去除液体,重复操作平衡一次。取样本100μl,U9处理,加入芯片,置于层析柜1h,快速拍干,加入Binding Buffer200μl振荡(600rpm,室温,5min),甩去残液,快速拍干,重复操作2次。清洗、甩干、置于Bio-processor中,干燥后加入1μl的SPA溶液(50%),重复一次此操作,待自然干燥即可在SELDI-TOF-MAS平台上检测。设置SELDI-TOF-MS参数,将结合好待测样品的蛋白质芯片装入SELDITOF-MS中进行检测,对血清差异性蛋白质进行筛选。采用Ciphergen Biosystems软件3.1版本原始数据进行校正,采用ZUCIPDAS网络服务软件分析蛋白质芯片数据,得到样本中各个m/z及其对应的蛋白质峰值,将m/z差异小于0.3%的归为同一类。质谱数据过滤噪音,聚类分析,使用SPSS17.0统计分析。再经过SVM筛选出youden指数最高的组合模型,得出肝母细胞瘤特异性血清蛋白质标记物,同时对不同组别进行统计学分析,对比该标记物在肝母细胞瘤不同分期、不同手术方式、不同诊疗阶段患儿血清中的表达差异。2.2.2肝母细胞瘤血清蛋白质标记物的纯化与鉴定取目标蛋白质表达量较高的血清样本作为分离纯化对象。取100μl血清样品,将血清样本用ACN沉淀大分子蛋白质,用C18反相高压液相色谱柱对经上述处理后的血清样品进行分离纯化,用EP管收集对应于HPLC图上峰值中的蛋白质,真空浓缩至20μl,进一步检测、找出目标蛋白质所在的样本。在纯化后的目标蛋白质内,依次加入尿素、DTT、NH4HCO3、胰酶等,37℃酶解过夜,终止酶解反应,离心取上清,加入到C18蛋白质样品检测的梯度洗脱柱,与2D-LC-LTQ-MS系统串联,检测肽段质荷比图谱,通过数据库检索,得到相匹配的蛋白质。2.2.3肝母细胞瘤血清蛋白质标记物的验证及动态对比2.2实验方法采用ELISA方法对每组随机抽样进行检测。取标准品、样品各100μl分别加入预包被抗人Apo A-I抗体的96孔板中;稀释,孵育,洗板,依次加入作用液体,直至加终止液终止显色反应。读出各孔吸光值,绘制标准曲线,计算样品浓度。3结果3.1肝母细胞瘤血清蛋白标记物的筛选本试验结果得出m/z峰为9348Da的蛋白质或肽段为肝母细胞瘤血清蛋白质标记物。3.2目标蛋白标记物在肝母细胞瘤不同治疗阶段患儿血清中的表达对比对对照组、术前组、术后组、化疗组、治愈组、复发组中的m/z 9348Da蛋白质标记物统计学分析,该标记物在术前组、术后组、复发组中呈现低表达;在对照组、化疗组、治愈组中高表达;表达强度分别为3893.21±593.03、1713.31±316.55、2213.85±247.15、2996.72±541.58、3610.36±310.07、913.37±230.72,上述各组两两对比,除术前组、术后组、复发组差异无明显统计学意义外,其他各组均有统计学差异。3.3目标蛋白质标记物在不同分期肝母细胞瘤患儿血清中的表达对比对各组进行上述方法筛选并统计学分析,得出质荷比为9348Da的蛋白质或肽段在各组中的表达差异。术前pre-text分期筛选得出I期、II期、III期、IV期表达强度分别为2524.12±679.42、1718.90±418.62、1268.11±399.09、635.91±237.56,I期、II期差异无统计学意义(P=0.0386>0.01),其余任意相邻两组数据之间差异有统计学意义,P<0.01。3.4肝母细胞瘤血清标记物的纯化及鉴定将蛋白质经高效液相色谱分析纯化、收集,找出质荷比为9348Da的样品,将找到的质荷比为9348Da的蛋白质或肽段进行酶解并通过2D-LC-LTQMS系统检测,与数据库比对发现其为Apo A-I的一个肽段。3.5不同分期肝母细胞瘤术前血清中蛋白质标记物表达量的对比取肝母细胞瘤不同分期血清样本各10个,应用ELISA法检测各组Apo A-I蛋白质的浓度,结果示I期、II期、III期、IV期依次为154.14±34.45μg/m L,130.51±31.37μg/m L,86.32±14.44μg/m L,32.87±16.44μg/m L,相对于正常对照组均为低表达,表达强度依次降低,且各组均有统计学差异。3.6不同治疗阶段血清中蛋白质标记物表达量的对比取正常对照组、术前组、术后组、化疗组、治愈组、复发组的血清样品各10个,应用ELISA法检测各组Apo A-I蛋白质的浓度,结果示各组蛋白质浓度分别为正常对照组为235.34±14.42μg/m L;术前组为81.26±17.18μg/m L;术后组110.52±17.47μg/m L,化疗组229.02±7.65μg/m L;治愈组222.14±20.23μg/m L,复发组90.63±13.58μg/m L。统计学结果显示:治愈组与正常组血清中Apo A-I蛋白表达无统计学差异(p>0.01),其余各组与正常组中均有统计学差异(p<0.01);复发组与术前组血清中Apo A-I蛋白表达无统计学差异(p>0.01),其余各组与术前组中均有统计学差异(p<0.01);术后组、化疗组中Apo A-I蛋白表达有统计学差异(p<0.01)。3.7不同手术方式患儿不同阶段血清中蛋白质标记物表达量的对比取试验中III、IV期患儿根据不同的手术方式分为血管结扎组及血管修补组,应用ELISA法对两组不同阶段血清组Apo A-I蛋白质的浓度做出检测,结果显示:两组术前差别无统计学意义;术后及化疗后浓度均有升高,血管修补组较结扎组升高较多,差异有统计学意义;两组治愈后的差别无统计学意义,但临床资料显示,结扎组总治愈率较修补组稍低。3.8不同预后患儿血清中蛋白质标记物表达量的对比取预后不良组、预后良好组血清各10份,应用ELISA法检测各组Apo A-I蛋白质的浓度,结果显示:分别为预后不良组:39.17±16.92μg/m L,预后良好组:97.38±41.83μg/m L;二者差别有统计学差异(p<0.01)。4结论1.本研究发现质荷比为9348Da的蛋白质或肽段为肝母细胞瘤特异性血清标记物。2.质荷比为9348Da的蛋白质或肽段经过鉴定其为Apo A-I,它在肝母细胞瘤患儿血清中的表达与健康儿有统计学差异,可作为HB血清生物学标记物应用于临床,对构建肝母细胞瘤诊疗的网络构建有临床意义。3.Apo A-I的含量在肝母细胞瘤患儿与正常儿血清中存在的差异有统计学意义,在肝母细胞瘤不同期别患儿中的差异有统计学意义,不同手术方式、治疗不同时期的差异亦有统计学意义,不同预后的患儿术前该蛋白质表达差异有统计学意义。4.不同手术方式患儿术后该标记物的含量差别有统计学意义,其差别与临床预后吻合,该结论支持手术切除肿瘤对肝母细胞瘤生存率起重要作用,且血管修补是III、IV期患儿手术中的重要技术。