研究背景和目的糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)作为糖尿病最重要的并发症之一,因为人们生活水平的提高,糖尿病也逐渐成为了影响人类健康的重要疾病,而糖尿病肾脏病的发病率自然是随之不断升高,目前在许多国家和地区已经成为终末期肾病(ESRD)的首位原因,显著增加了糖尿病患者的死亡率。由于糖尿病肾脏病患者体内存在着复杂的代谢紊乱现象,使对发展到终末期的DKD进行治疗面临着极大的挑战和困难,非常容易导致患者死亡。因此,寻求更早期、更有效的预防和治疗糖尿病肾病的新切入点,阻止或延缓DKD进展是医学界至今未能解决的一项难题,探讨DKD的发病机制,寻找新的、有效的防御和治疗方法具有紧迫性,也具有着非常重要的医疗和社会价值。过去人们以为,糖尿病肾脏疾病是以肾小球病变为主的疾病,新近的研究发现:在DKD的发生发病过程当中,肾小管细胞的损伤发挥着与肾小球损伤同等甚至更早期的重要作用。有鉴于此,对肾小管损伤的研究显得非常重要而必要,使其成为了近年来对DKD相关研究的一个重要领域。microRNA(miRNA)是一种单链非编码RNA,大概由22-24个核苷酸组合而成,能够特异性识别靶基因mRNA的3’非编码区并与之靶向结合,以发挥使mRNA降解或者抑制mRNA蛋白翻译的调控作用,这种结合机制非常灵活而复杂,它既可作用于一种生物学功能蛋白的mRNA,也可以作用于多种不同的生物学功能蛋白的mRNA,充分参与到细胞的生长、增殖、分化、死亡等几乎是每个重要的生命过程当中,发挥着重要作用,因而跟生命过程中无论是正常发育还是病理疾病,均有着非常密切的关系。miRNA的表达异常与很多疾病密切相关[1-6]。研究证明,miRNA也可以参与自噬发生的各个阶段,并起到相应直接或间接的调控作用[7-12]。Sirt1,属于依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的Ⅲ型去乙酰化酶,本身为酵母沉默信息调节因子的一种同源蛋白,是Sirt2在人体中的类似物。Sirt1具有将组蛋白去乙酰化的能力,同时对于一部分非组蛋白也具有使其去乙酰化的作用,比如抑癌基因p53。Sirt1同时也是调控多种细胞自噬的关键基因,可以促进细胞内自噬活性[13-18]。基于microRNA可以与目的基因结合影响其表达和功能的特性,也有部分研究发现了 Sirt1可以受某些miRNA的控制从而进一步影响到细胞内部的自噬功能状态[19-26]。自噬或自噬反应被定义为细胞在溶酶体系统的作用下对由细胞摄取的或原有的细胞组分进行自我消化的过程。当哺乳动物细胞处在饥饿、能量不足、疾病等应激状态下,自噬反应是维持细胞内环境稳定,保证大分子蛋白、细胞器循环利用和细胞器质量的主要方式,是一种比泛素-蛋白酶系统更强大和特异的蛋白降解途径,对于清除细胞内入侵物、错误折叠的蛋白、过氧化和衰老的蛋白等作用特异而强大。自噬可以长期避免组织受损,也可在短期内机体应激状态下维持内环境的稳态。[27-33]。方法1.细胞培养在 MEM(Gibco,Invitrogen)中补充 10%FBS(Gibco,NZL),在 37℃和5%C02下培养人肾脏近端肾小管(HK-2)细胞。每两天更换一次培养基,等待 HK-2 细胞生长至 60%,使用 MEM(Gibco,Invitrogen)补充2%FBS(Gibco,NZL)的培养基饥饿培养24小时,将细胞分成两组。第1组:正常葡萄糖浓度(5.6mmol/L)的培养基作为对照。第2组:补充有高葡萄糖(30mM)培养基的高糖刺激组。所有细胞与培养基一起温育72小时。2.RNA提取、逆转录和定量实时RT-PCRTrizol法提取细胞组织总RNA,使用分光光度计定量核酸。使用M-MLV逆转录酶试剂将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR法进行实时荧光定量PCR反应。基因表达量按2-△△Ct方法计算得出。β-actin作为内参基因。3.蛋白提取及Western blot用RIPA法提取细胞总蛋白,BCA法测定样品蛋白浓度,100℃水变性蛋白。配制8%-15%的SDS-PAGE胶,电泳分离样品蛋白,湿转目的蛋白到PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉或者5%BSA的TBST封闭PVDF膜,将目的蛋白的一抗稀释后与PVDF膜在4℃摇床上孵育过夜。第二天,PVDF膜置于TBST洗涤,再与稀释好的二抗(1:15000)避光孵育1h,再次置于TBST洗涤后,使用天能Tanon 5500全自动化学发光成像分析系统发光显影,并用凝胶图像分析系统(Quantity One)分析结果。4.细胞转染1)为了实现miR-155-5p表达的变化,使用LipofectamineTM 3000作为转染试剂转染 miR-155-5p mimic/inhibitor 入 HK-2 细胞。2)为了实现Sirt1表达的变化,使用LipofectamineTM 3000作为转染试剂转染pCMV-SIRT1质粒或si-Sirt1入HK-2细胞。3)为了实现P53表达的抑制,使用P53抑制剂Pifithrin-α处理HK-2细胞。5.双荧光素酶报道基因测定使用PCR扩增来自HK-2细胞基因组DNA的miR-155-5p和Sirt1 3’UTR结合位点(引物:正向:5’-CCGCTCGAGTGTAATAATTGTGCAGGTACAG-3’;反向:5’-ATTTGCGGCCGCAAAGTTAGTGTTGAGTTTGTAC-3’)。使用 Xho1和NotI限制位点分别将扩增的Sirt1 3’UTR片段插入psi-Check2载体(Ribobio,广州,中国)。用构建有Sirt1和miR-155-5p结合位点的双荧光素酶报告基因载体 psi-Check2(1 μg)和 miR-155-5p mimic/inhibitor 共转染,检测荧光比值。6.Chip分析软件预测miR-155-5p启动子区域中p53结合位点的存在。用1%福尔马林处理细胞并超声处理收集可溶性染色质上清液,与抗p53抗体过夜,小鼠IgG免疫沉淀作为阴性对照。洗涤免疫复合物并获得DNA样品。通过使用含有miR-155-5p启动子区域和P53结合位点的引物qRT-PCR分析回收的DNA。7.统计分析所有试验数据采用均数士标准差(x±SD)表示。多组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA)。正态分布两样本之间的比较则采用两独立样本t检验,当统计结果的P值<0.05时,被认为具有统计学差异。结果1.高葡萄糖刺激的HK-2细胞的相关指标表达测定将该试验分成两组,正常葡萄糖(5.6mM)和高葡萄糖(30mM),同步化HK-2细胞后刺激72小时提取总RNA和蛋白质用于分析。发现高糖刺激后,miR-155-5p表达升高,Sirt1表达受抑制,P53表达升高,自噬活性受抑制,纤维化相关指标表达增强。2.MiR-155-5p对Sirt1的直接调控miR-155-5p mimic 或 inhibitor 转染 HK-2 细胞验证成功,qRT-PCR 和 WB检测发现miR-155-5p过表达之后Sirt1表达降低、自噬活动受抑制,纤维化指标表达增强,而miR-155-5p表达抑制之后相应改变则会被逆转。随后,我们构建了含有Sirt1 3’UTR区与miR-155-5p结合位点的双荧光素酶报告基因质粒载体 psi-Check2,与 miR-155-5p mimic/inhibitor 共同转染。结果显示与 miR-155-5p mimic共转染的psi-Check2荧光比率显着降低,反之则增加,表明miR-155-5p和Sirt1 3’UTR区结合。3.Sirt1对P53的调控用 LipofectamineTM 3000 转染 pCMV-SIRT1 质粒或 si-Sirt1,验证过表达或抑制成功后,通过qRT-PCR和WB,观察到在高糖条件下Sirt1过表达后P53表达显着降低,并且在Sirt1被抑制后该效应会被逆转。证明在高葡萄糖处理的HK-2细胞中sirt1可以发挥抑制P53表达的作用。4.P53 对 miR-155-5p 的调控我们使用Chip实验来验证高糖培养的HK-2细胞中p53是否可以调控miR-155-5p基因表达。发现高糖刺激可使P53和miR-155-5p启动子区域结合的表达上调,同时使用抑制剂Pifithrin-α抑制P53表达之后,观察到miR-155-5p表达下降。结论1.高糖状态下miR-155-5p表达升高,Sirt1、自噬等保护性因素受抑制,P53及纤维化指标表达增强。2.miR-155-5p可以与Sirt1 3’UTR区特异性结合,抑制其表达。3.Sirt1可以抑制P53表达,促进自噬活性,抑制纤维化指标表达。4.P53与miR-155-5p启动子区可特异性结合,并可促进miR-155-5p表达。证明了高糖诱导的肾小管细胞损伤信号环路p53/miR-155-5p/Sirt 1的存在。