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目的利用多位点序列分型方法研究马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,TM)的流行病学特点,分析竹鼠分离株与临床分离株的遗传特征和进化关系。方法(1)实验分为4组,实验组1为8株竹鼠分离株;实验组2为7株临床分离株;实验组3为15株TM模拟感染动物组:将实验组1、2的15株TM分别制成活菌悬液,调整孢子浓度为5×10~7CFU/ml,取50ul活菌悬液经呼吸道滴入感染15只小鼠,两周后处死小鼠,取组织进行培养;实验组4为15株TM模拟感染人支气管上皮细胞组:实验组1、2的15株TM分别制成活菌悬液,在37℃,与细胞共孵育4h后,加制霉菌素共培养5h,用磷酸盐缓冲液清洗掉细胞外的孢子,然后加Tritonx-100培养15min,滴管吹打混匀,取适量该液体至马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar,PDA)培养基上培养。(2)将菌株接种于PDA培养基上,置于25℃培养1周后,刮去菌落,用液氮研磨法提取DNA。(3)用聚合酶链式反应扩增GPDH、SET domain protein、Superoxide dismutase、B6Q3E1_PENMQ、B6QLV1_PENMQ,然后进行基因测序。(4)基因测序结果利用clustalx1.83、Bioedit、DNAstar软件获得菌株的等位基因普和序列型(sequence type,ST);利用START2软件计算出序列的多态性指标;利用辛普森指数作为判断分辨力的指标;利用BURST(Based Upon Related Sequence Types)运算法将菌株归为谱系;利用MEGA5.1(Molecular Evolutionary Genetics Analysis,version 5.1)软件构建聚类分析树。结果(1)感染动物和细胞模型的细胞和组织均能培养出TM的黄绿色绒毛状典型菌落,能产生浸入培养基的玫红色色素。(2)各菌株的5个基因分别进行聚合酶链式反应扩增,均能扩增出单一的阳性条带,条带清晰,扩增率达100%。(3)45株TM被分为10个ST型,出现频率最高的ST型为ST-2(15株,33.3%),有3个ST型只有一株分离株,而剩下的6个ST型分别包括了2到12不等的分离株。(4)5个基因的等位基因数从4个(B6Q3E1_PENMQ、B6QLV1_PENMQ)到2个(GPDH、Superoxide dismutase),各基因的核苷酸多态性位点数为0.34%(Superoxide dismutase)至0.74%(GPDH)。GPDH基因的d_N/d_S率(非同义突变与同义突变的比值)小于1,而余下4个基因该值均为0。(5)通过BURST软件的分析,10个ST型被分为:1个同源复合体,1个双联体,2个独特型。同源复合体包括30株分离株,涵盖了6个ST型(ST-2、ST-3、ST-5、ST-6、ST-7和ST-8),其中ST-5被定义为该同源复合体的始祖序列型,双联体包括ST-1和ST-9,ST-4和ST-10是独特型,不属于上述同源复合体或双联体。(6)用邻接法构建的聚类分析树主要包括两个群。来自ST-1分支的可信度为80%,包含了临床分离株(1株,14.3%)、竹鼠分离株(2株,25%)、感染动物分离株(4株,26.7%)和细胞分离株(5株,33.3%);来自ST-2分支的可信度为72%,包含了临床分离株(1株,14.3%)、竹鼠分离株(4株,50%)、感染动物分离株(5株,33.3%)和感染细胞分离株(5株,33.3%)。结论(1)45株TM分为10个ST型,使人支气管上皮细胞、小鼠和人类有较高的感染频率是ST-1、ST-2型。(2)本研究的5个基因位点的基因多态性较低,即基因变异度低,说明在进化过程中基因相对较为保守,但是5个基因位点的辛普森指数较高,表明多位点序列分型可用于区分不同来源的TM菌株。(3)临床分离株和竹鼠分离株有相同的ST型,表明TM对人和竹鼠的感染具有同源性。