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研究背景卵巢癌是困扰女性生殖健康的主要恶性肿瘤之一,发病率在发达地区显著高于欠发达地区,并且在全世界范围内有逐渐升高的趋势。卵巢癌易复发、易转移,其致死率位居所有妇科肿瘤首位[1],严重的威胁女性的生命健康。因此,研究卵巢癌增殖、转移、复发机制迫在眉睫。斯钙素1(stanniocalcin 1,STC1)于1995年被发现于人类基因组中[2],与鱼以及其他脊椎动物有着高度的同源性。它是自分泌/旁分泌的激素蛋白[3],主要功能是局部调节钙离子和磷酸离子的运输[4]。STC1作为一个分泌性激素蛋白,在健康人群血清中含量极低[5],但是在包括卵巢癌在内的多种癌症STC1表达量明显增高[6]。在前期研究中我们发现,STC1可以增强卵巢癌细胞的增殖、转移能力[6],但是作用机制不详。研究发现STC1是作用于线粒体的激素之一,可以正向调控线粒体传递链传递速率,增加细胞线粒体的呼吸效率,提供更多能量[7],但是具体调节机制需要进一步研究,研究STC1对于氧化磷酸化的调控机制对于探索STC1促进卵巢癌发生发展的机制具有重要意义。线粒体是真核生物中重要的细胞器,是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所,为细胞的活动提供能量[8]。虽然线粒体基因很小(16.6 kb),但线粒体基因组编码13个蛋白质,这些蛋白质与核起源的其他蛋白质形成电子传递链复合体[9]。线粒体参与着重要的肿瘤特征[10,11],如肿瘤的扩散和转移[12]、耐药[13]等。氧化磷酸化是大多数恶性肿瘤[14]的主要能量来源,研究发现卵巢癌细胞对氧化磷酸化代谢依赖性增加并且对氧化磷酸化抑制剂的敏感性增加[15]。提示我们可以通过抑制电子传递链(ETC)来抑制肿瘤的生长,这对于卵巢癌的治疗提供了新的方向。本研究准备在卵巢癌中探索STC1在氧化磷酸化中发挥的作用,进而揭示STC1促进卵巢癌发生发展的分子机理,为卵巢癌的治疗提供新的靶点。研究目的本研究在卵巢癌细胞OVCAR3中通过核质分离、免疫荧光验证STC1是否在OVCAR3细胞的线粒体中有分布;利用RNA-seq技术得到低表达和过表达STC1的OVCAR3细胞系的差异表达基因表,通过基因集富集分析(GSEA)分析,找出STC1是否参与氧化磷酸化;然后在低表达和过表达STC1的OVCAR3细胞系中,通过qPCR、Western blot技术检测STC1是否对于线粒体氧化磷酸化相关基因有影响;通过免疫共沉淀技术验证STC1是否和电子传递链有结合。本研究通过探究STC1在卵巢癌细胞中调节线粒体氧化磷酸化的机制,进一步探索STC1促进卵巢癌发生发展的分子机制。研究方法1.利用核质分离和激光共聚焦免疫荧光技术确定STC1在OVCAR3细胞的线粒体中的分布情况。2.使用慢病毒系统构建低表达和过表达STC1的OVCAR3细胞系。3.利用RNA-seq技术获取低表达和过表达STC1的OVCAR3细胞系的差异基因,差异基因通过基因富集分析(GSEA)探索STC1是否参与氧化磷酸化过程。4.在低表达和过表达STC1的OVCAR3细胞系中,通过使用Western blot和qPCR技术检测线粒体编码的电子传递链复合体Ⅰ(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)、复合体 Ⅲ(CYB)、复合体 Ⅳ(Cox1、Cox2、Cox3)、复合体V(ATP6、ATP8)和2个线粒体核糖体RNA(MT-12S、MT-16S)以及核基因编码的核呼吸因子(NRF1、NRF2)、线粒体DNA转录因子(TFAM、TFB2M)、线粒体聚合酶(POLRMT)的mRNA、蛋白的表达水平。5.在OVCAR3细胞系中,通过免疫共沉淀技术验证STC1与线粒体内膜电子传递链复合体相关蛋白是否有互作。研究结果1.用Western blot法检测显示OVCAR3全细胞裂解液,线粒体组分,细胞核组分,细胞质组分中发现均有STC1蛋白存在。激光共聚焦免疫荧光检测显示STC1与DAPI和线粒体标志物TOMM20共定位,说明STC1在线粒体中有分布。2.通过RNA-seq数据的GSEA分析,结果显示:在低表达STC1组中,多个核基因编码及线粒体基因编码的氧化磷酸化基因显著下调。在过表达STC1组中,多个核基因编码的氧化磷酸化基因显著上调。证实STC1显著影响氧化磷酸化通路。3.在低表达STC1的OVCAR3细胞中,qPCR检测结果显示:线粒体编码的电子传递链复合体Ⅰ(ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)、复合体Ⅲ(CYB)、复合体Ⅳ(Cox3)、复合体V(ATP8)和2个线粒体核糖体RNA(MT-12S、MT-16S)以及核基因编码的核呼吸因子(NRF1、NRF2)、线粒体DNA转录因子(TFAM、TFB2M)、线粒体聚合酶(POLRMT)的mRNA水平有显著下调。Western blot检测结果显示:线粒体编码电子传递链复合体Ⅰ蛋白MT-ND5和复合体Ⅲ蛋白MT-CYB以及核基因编码的核呼吸因子(NRF1、NRF2)、线粒体DNA转录因子(TFB2M等)、线粒体聚合酶(POLRMT)的表达显著降低。在过表达STC1的OVCAR3细胞系中qPCR检测结果显示:线粒体编码的电子传递链复合体 Ⅰ(ND3、ND4、ND6)、复合体 Ⅲ(CYB)、复合体 Ⅳ(Cox1、Cox2、Cox3)、复合体V(ATP6、ATP8)和线粒体核糖体RNA(MT-12S)以及核基因编码的线粒体DNA转录因子(TFAM、TFB2M)的mRNA水平上调;通过Western blot检测结果显示:线粒体编码电子传递链相关蛋白MT-ND5的表达上升。4.免疫共沉淀结果显示:OVCAR3细胞中STC1结合线粒体内膜电子传递链复合物Ⅰ中MT-ND5蛋白和复合物Ⅳ的MT-CO1。研究结论1.STC1在细胞核、线粒体还有细胞质均存在分布。2.STC1可以通过基因调控影响氧化磷酸化相关蛋白的表达。3.STC1与线粒体电子传递链有相互作用。