【摘 要】
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目的:Bmal1是一个非常重要的生物钟基因,而生物节律紊乱是帕金森病常见的非运动症状之一,但生物钟基因在帕金森病中的作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨Bmal1敲除(Bmal1-/-)
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目的:Bmal1是一个非常重要的生物钟基因,而生物节律紊乱是帕金森病常见的非运动症状之一,但生物钟基因在帕金森病中的作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨Bmal1敲除(Bmal1-/-)小鼠对MPTP药物的敏感性,以及Bmal1敲除后引起的生物节律紊乱和神经炎症在帕金森病发生中的机制研究。方法:离体实验主要以BV2细胞和原代培养的小胶质细胞为研究对象,采用Q-PCR方法检测si RNA敲减Bmal1,在细菌脂多糖(LPS)或1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)的作用下相关炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、i NOS m RNA水平的变化。原代小胶质细胞上清和中脑多巴胺能神经元共培养后,运用免疫荧光法检测多巴胺能神经元神经突起的变化。采用Western blotting检测在LPS的作用下,BV2细胞上NFκB通路中相关蛋白的表达。在体实验以6月龄的Bmal1-/-雄性小鼠及同窝出生的野生型小鼠为实验对象,腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)建立急性PD小鼠模型。两周后,通过转棒实验和旷场实验评价造模是否成功,利用代谢笼监测系统检测小鼠生物节律的变化。采用Western blotting检测纹状体中TH蛋白的表达水平,Q-PCR法检测炎症因子IL-1β和TNF-α的变化;利用高效液相色谱法检测纹状体中多巴胺(DA)和多巴克(DOPA)的含量;运用免疫组化法观察多巴胺能阳性神经元和神经纤维以及小胶质细胞和星形胶质细胞的形态和数量的变化。结果:离体实验结果显示,经LPS或MPP+处理后,在m RNA水平上,相较于载体对照组(NC),si-Bmal1组中IL-1β和TNF-α表达上调(P<0.01)。经LPS或MPP+处理的小胶质细胞上清作用后,si-Bmal1组中多巴胺能神经元的神经突起明显变短。Western blotting结果显示NFκB信号通路相关蛋白的磷酸化水平均发生变化。在LPS处理15min时,P-IKK/IKK的磷酸化水平升高,且si-Bmal1组的表达高于NC组(P<0.05)。在LPS处理30min时,P-IκB/IκB和P-P65/P65的磷酸化水平升高,且si-Bmal1组的表达高于NC组(P<0.01)。在体实验结果显示,在MPTP模型中,相较于野生型小鼠,Bmal1-/-小鼠的运动能力明显下降(P<0.05),代谢笼实验结果显示X、Y、Z三个维度上的活动次数增加(P<0.05),饮食、饮水及热量消耗均减少,提示Bmal1基因的缺失引起生物节律紊乱;Bmal1-/-小鼠的黑质和纹状体区多巴胺能阳性神经元和神经纤维大量丢失(P<0.05),多巴胺的含量也显著下降(P<0.05)。在MPTP模型中,相较于野生型小鼠,Bmal1-/-小鼠纹状体区IL-1β和TNF-α的表达量较高(P<0.05),免疫组化结果显示小胶质细胞和星形胶质细胞大量激活。提示Bmal1基因的缺失加重了炎症反应,影响多巴胺能神经元的死亡,从而影响PD的发生。结论:Bmal1-/-小鼠对MPTP药物更敏感,Bmal1基因的缺失会引起更为严重的炎症反应并导致多巴胺的大量丢失,从而加快了帕金森病的发生。
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