罗非鱼无乳链球菌病DNA疫苗的研究及有效中草药的筛选

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近年来,链球菌病的爆发给我国罗非鱼养殖业造成了重大的经济损失,目前链球菌的防治尚无完全有效的方法,虽然生产中有使用抗生素来控制链球菌病,但实际效果并不理想,且抗生素滥用所导致的环境问题以及食品安全问题越来越受到诟病。本文对华南地区主要罗非鱼养殖区的无乳链球菌进行了流行病学调查,并研究了DNA疫苗以及中草药防治罗非鱼链球菌的可行性。本文首先在广东、海南、广西等地罗非鱼养殖场分离了近40株病原菌,通过特异PCR以及API20strep生化鉴定等方法把这些病原菌鉴定为无乳链球菌。之后,通过多重PCR方法以及血清学凝集方法确定无乳链球菌分离株的血清型为Ia型,为疫苗防治研究提供了理论基础。通过药敏试验,鉴定了本文所分离的罗非鱼无乳链球菌对氟苯尼考、氯霉素、呋喃妥因、强力霉素、四环素、美满霉素、交沙霉素、乙酰螺旋霉素、克林霉素(氯洁霉素)、先锋霉素VI、利福平、加替沙星、奥复星(氧氟沙星)等13种抗生素敏感,对青霉素中度敏感,对氟啶酸、氟罗沙星、新霉素、卡那霉素、链霉素、多黏霉素B等6种抗生素不敏感。另外,从广东省某工厂化宝石鲈养殖场分离鉴定出无乳链球菌,其生化特征、耐药性与血清型等特征与之前采集的罗非鱼源无乳链球菌类似,此为首次有关宝石鲈感染无乳链球菌的报道。另外,流行病学调查结果显示,链球菌病多在高温季节发生,通过在不同水温条件下人工感染实验,验证了高温为链球菌病发生的关键因素。DNA疫苗是近年来随着基因治疗技术的发展而产生的一种新型疫苗。与传统疫苗相比,DNA疫苗具有容易操作、性状稳定、容易储存与运输、安全无毒等优点。为了探索DNA疫苗防治链球菌病,本文克隆了无乳链球菌THN株的表膜抗原基因sip,构建得到pcDNA3.1_sip真核表达载体。通过背部肌肉注射的方法免疫罗非鱼,免疫一个月后进行攻毒试验检验该DNA疫苗的保护效果,结果显示pcDNA3.1_sip免疫组死亡率大大低于对照组死亡率,其相对保护率为46%。由于疫苗在生产上的推广使用尚需时日,因此迫切需要寻找一种安全、高效的药物来防治罗非鱼链球菌病。现在的资料的表明,中草药是一种高效安全的药物,是替代抗生素和化学药物防治水产病害的有效途径之一。为此,本文选取了25种具有广谱抗菌活性的中草药,通过抑菌圈测定初步筛选了黄连、五倍子、大黄、黄柏、丁香、地榆、黄芩与石榴皮等8种具有抑菌活性的中草药;然后,通过水煮法提取了这8种中草药的有效成分,采用K-B法测定了抑菌圈大小,同时确定了最小抑菌活性与最小杀菌活性,确定黄连是体外实验中抗无乳链球菌效果最佳的中草药。之后,把黄连以5%的含量添加到基础饲料中,每日投喂2%罗非鱼体重的混合饲料,连续投喂1周后,测定罗非鱼先天性免疫因子(包括血清的溶菌酶、白细胞的呼吸爆发活性以及旁路补体途径ACH50),并进行了攻毒试验。实验结果显示:虽然投喂了黄连的罗非鱼的先天性免疫因子与对照组相比未发生显著性变化,但是投喂了1%含量的黄连可使罗非鱼产生80%的相对保护率。
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