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近年来,H5N6已逐渐取代H5N1成为我国主要流行的H5亚型高致病性禽流感病毒(avian influenza virus,AIV),且随着病毒的不断进化其基因组构成日趋复杂,部分流行株的6个内部基因甚至全部由S基因型H9N2(H9N2/S)病毒提供。而当前国内鸡群中占据优势的H9N2/S,相较于前期流行的H基因型(H9N2/H),在分子进化上显著的变化特征是PB2和M基因由G1-like替代了 F/98-like,并且禽体内与人感染病例中均已经出现了内部基因完全来源于H9N2/S的新型重组H5N6/S、H7N9/S、H10N8/S等病毒。因此,研究G1-like与F/98-like进化谱系的PB2基因对H5N6/S病毒复制能力的影响及相关机制,将为进一步解析H9N2/S病毒作为新型重组流感病毒内部基因供体的分子机制提供重要参考。1.从病毒竞争性重配角度探究不同来源PB2基因对重组H5N6亚型AIV复制能力的影响为了从病毒竞争性重配角度评价G1-like与F/98-like PB2基因在H5N6亚型AIV复制中的作用,选取3株H5N6/S流行株MZ34、YB0597和JT131,利用反向遗传学技术在MZ34的8基因重组质粒基础上另外添加F/98-like来源的PB2和M质粒,即以MZ34(8)+F/98(PB2+M)的10质粒共转染细胞进行重组H5N6病毒的竞争性拯救;并对拯救病毒经3轮空斑纯化后PCR扩增PB2和M基因进行测序。同时,为排除来源于同一母本病毒的8质粒易于自我组合包装的可能干扰,又将MZ34的PB2和M质粒替换为YB0597或JT131来源再次进行测定。结果显示,从拯救的重组H5N6病毒PB2和M基因的构成情况来看,G1-like PB2基因在各1 0质粒转染组的数量上均占绝对优势,G1-like M基因仅在MZ34(8)+F/98(PB2+M)组占优势。同时,相较于F/98-like PB2基因,含G1-like PB2基因的重组H5N6亚型AIV在CEF、A549、MDCK细胞上均具有更强的复制能力。表明,相较于F/98-like,G1-like PB2基因在H5N6病毒重配中具有显著的竞争优势,增强了 H5N6亚型AIV复制能力。2.从聚合酶活性角度探究不同来源PB2基因影响重组H5N6亚型AIV复制能力的分子基础为从聚合酶活性角度探究具有优势作用的G1-like PB2基因对H5N6病毒复制能力的影响及相关分子基础,本章基于H5N6/S代表株MZ34与H9N2/H代表株SH14,分别将其PB2基因按结构域分布划分为连续的三段,构建结构域相互嵌合型PB2质粒,鉴定G1-like PB2基因影响聚合酶活性的关键结构域及氨基酸。结果显示,在MZ34-PB2基因上替换入SH14-PB2的N端结构域(aa:1-250)或将89位氨基酸由蛋氨酸(M)突变为缬氨酸(V)后,聚合酶活性均显著降低。同时,相较于MZ34母本毒,PB2-M89V突变病毒能显著降低PB2基因的mRNA、vRNA、cRNA合成能力与PB2、PB1、NP蛋白表达水平。表明,相较于F/98-like,G1-like PB2基因显著增强了 H5N6亚型AIV的聚合酶活性;其中,G1-like PB2基因的N端是发挥作用的关键结构域,89M是关键的氨基酸位点。3.从帽结合能力角度探究不同来源PB2基因影响H5N6亚型AIV复制能力的相关机制另一方面,为从帽结合能力角度探究具有优势作用的G1-like PB2基因对H5N6病毒复制能力的影响及相关机制,本章仍以MZ34、SH14毒株为研究对象,初步探究其体外表达的cap-binding结构域蛋白与m7GTP的帽结合能力差异,并通过比对G1-like与F/98-like PB2基因序列,统计分析影响帽结合能力差异的潜在氨基酸位点。结果显示,真核表达的MZ34cap与m7GTP的结合能力显著高于SH14cap,表明cap-binding 结构域的帽结合能力可能是G1-like 与 F/98-like PB2 基因影响 H5N6 亚型 AIV复制能力差异的潜在机制;另外,G1-like PB2基因的340R、389K、456N可能是增强帽结合能力的关键氨基酸位点,值得进一步研究。