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过量氟可对神经系统产生神经毒性作用,但其具体作用机制尚不清楚。突触结构和功能在学习记忆的形成和维持中具有重要作用,受脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)/酪氨酸蛋白激酶受体B(tyrosine kinase receptor,TrkB)通路的调控,同时,BDNF的表达依赖于细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)的激活,且ERK1/2磷酸化与神经系统功能损伤密切相关。然而,突触结构和功能、BDNF/TrkB通路及ERK1/2在氟致神经毒性中的作用及机制鲜有报道。第一部分突触损伤、BDNF/TrkB通路异常和ERK/CREB通路激活在氟致SD大鼠发育神经毒性中的作用目的:探讨氟暴露对子代大鼠学习记忆能力、海马组织突触数量、结构和功能、BDNF/TrkB通路及ERK/环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate-response element binding protein,CREB)通路的影响,为阐明氟致发育神经毒性的机制提供实验依据。方法:40只SPF级Sprague-Dewley(SD)大鼠(200±20 g,雌雄各半),按体重随机分为四组:对照组(水氟含量<1 mg/L)以及水氟含量为10、50、100 mg/L氟化钠(Sodium fluoride,NaF)染毒组,每组10只。各组大鼠饲以基础颗粒饲料,自由饮水。每天观察其进食、饮水等一般情况,并记录氟斑牙发生情况。染毒2月后合笼(雌:雄=1:1),怀孕母鼠分笼饲养,饲养及染毒条件不变,仔鼠出生21天后,按照与亲代相同的染毒方式和剂量染毒,直至子代大鼠6月龄时结束。利用Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力,Golgi染色观察大鼠海马组织中诱导记忆形成的关键亚区CA1区神经元树突分支数量及树突棘密度,Western blot检测大鼠海马组织中反映突触囊泡数量和突触传递神经递质能力的突触囊泡外膜特异性标志蛋白突触素(synaptophysin,SYN)、突触后致密区内含量最丰富且反映突触后信号传递能力的突触后致密蛋白-95(post-synaptic density-95,PSD-95),以及BDNF/TrkB通路关键蛋白BDNF、TrkB和ERK/CREB通路关键蛋白磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(phospho-extracellular signal-regulated protein kinase 1/2,p-ERK1/2)、磷酸化环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(phospho-cyclic adenosine monophosphate-response element binding protein,p-CREB)的蛋白表达水平,免疫组化检测大鼠海马组织SYN、PSD-95、BDNF和TrkB的定位表达。结果:Morris水迷宫定位航行实验结果显示,与对照组比较,50、100 mg/L NaF染毒组大鼠逃避潜伏期及游泳路程显著延长(P<0.05);空间探索实验结果显示,50、100 mg/L NaF染毒组大鼠在原平台所在象限的游泳时间(游泳路程)占总游泳时间(总游泳路程)的比例显著降低(P<0.05)。Golgi染色结果显示,随着NaF染毒剂量增加,大鼠海马组织CA1区神经元树突分支减少,与对照组比较,50、100 mg/L NaF染毒组大鼠海马组织CA1区神经元树突棘密度显著降低(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,50、100 mg/L NaF染毒组大鼠海马组织反映突触数量、结构和功能标志蛋白SYN和PSD-95的蛋白表达水平显著下降(P<0.05);各NaF染毒组BDNF蛋白表达水平均显著增加(P<0.05);50、100 mg/L NaF染毒组TrkB蛋白表达水平显著降低(P<0.05);100 mg/L NaF染毒组p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。免疫组化结果显示,100 mg/L NaF染毒组大鼠海马组织CA3-CA1区神经细胞胞质内SYN蛋白的阳性颗粒数量减少、染色变浅,PSD-95蛋白的阳性细胞数量减少;CA3-CA1和DG区神经细胞间和胞质内BDNF蛋白的阳性颗粒数量增加、染色变深、BDNF蛋白的阳性细胞数量增加,TrkB阳性细胞数量减少。结论:过量氟可导致子代6月龄大鼠空间学习记忆能力降低、大鼠海马组织神经元树突分支和树突棘密度减少以及突触结构和功能标志蛋白表达水平降低。此外,过量氟暴露可引起BDNF/TrkB通路蛋白表达改变并激活ERK/CREB通路。说明突触结构和功能损伤、BDNF/TrkB通路蛋白表达改变和ERK/CREB通路激活参与了氟的发育神经毒性。第二部分磷酸化ERK1/2介导的BDNF/Trk B通路异常在氟致SH-SY5Y细胞突触损伤中的作用目的:探讨ERK1/2磷酸化在氟致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞突触结构和功能损伤中的作用,为阐明氟神经毒性的作用机制提供基础依据。方法:将处于对数生长期的SH-SY5Y细胞分为对照组和三个Na F染毒组(Na F浓度分别为20、40、60 mg/L),染毒24 h后,用Western blot检测各组细胞突触结构和功能标志蛋白SYN和PSD-95、ERK/CREB通路关键蛋白p-ERK1/2和p-CREB、以及BDNF/Trk B通路关键蛋白BDNF和Trk B的蛋白表达水平。采用免疫荧光观察细胞形态、树突内PSD-95荧光斑点大小和数量以及细胞内p-ERK1/2蛋白的核转位情况。应用抑制ERK1/2磷酸化过程的丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)抑制剂PD98059(10μM)预处理细胞2 h,再Na F染毒24 h后,采用Western blot检测各组细胞突触结构和功能标志蛋白PSD-95、BDNF/Trk B通路关键蛋白BDNF和Trk B、以及上游信号调节分子p-ERK1/2的蛋白表达水平,并利用免疫荧光观察各组细胞形态和树突内PSD-95荧光斑点大小和数量。结果:Western blot结果显示,与对照组比较,60 mg/L NaF染毒组细胞突触结构与功能标志蛋白SYN和PSD-95蛋白表达水平显著降低(P<0.05);BDNF蛋白表达水平显著增高(P<0.05),而Trk B蛋白表达水平显著降低(P<0.05);细胞p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。免疫荧光结果显示,随着Na F剂量增加,细胞胞体变小、树突分支减少且长度变短、树突内PSD-95荧光斑点变小且数量减少;细胞核内p-ERK1/2荧光斑点聚集增强。抑制剂PD98059干预Na F染毒后发现,与Na F染毒组比较,Na F+PD98059组细胞p-ERK1/2、BDNF蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Trk B和PSD-95蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。免疫荧光显示,与Na F染毒组比较,Na F+PD98059组细胞树突分支数量增加、树突长度增加、树突内PSD-95荧光斑点变大且数量增加。结论:过量氟可导致SH-SY5Y细胞突触结构和功能受损并激活ERK/CREB通路,导致BDNF/Trk B通路蛋白表达改变。此外,MEK抑制剂可有效逆转过量氟引起的BDNF/Trk B通路蛋白表达改变及突触结构和功能损伤。提示ERK1/2磷酸化介导的BDNF/Trk B信号通路蛋白表达改变参与了过量氟导致的突触结构和功能损伤过程,且抑制ERK1/2磷酸化可通过影响BDNF/Trk B通路有效缓解过量氟对突触结构和功能的损伤作用。