中东呼吸综合征（Middle East Respiratory Syndrome,MERS）是由中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-coronavirus,MERS-CoV）感染所引起的一种高致病性呼吸道传染病,病程进展迅速且病死率高。自2012年9月首例MERS确诊病例在沙特阿拉伯被发现以来,截至2018年4月底,全球范围内已向世界卫生组织（World Health Organization,WHO）正式报告实验室确诊病例2 206例,其中相关死亡病例至少787例,病死率约35.7%。此外,MERS-CoV感染病例也由最初的中东地区扩散至在非洲、亚洲、欧洲和北美洲等27个国家均有发现。高病死率、广泛的病例分布、人际传播的发生和聚集性疫情的出现,使MERS疫情已引起国际社会的高度关注和担忧,MERS也已成为WHO公布的“预防传染病研发行动蓝图”中在列的优先研究的11种传染病之一。当前,尚无获批的针对MERS-CoV的特异性疫苗和治疗药物,减少人类暴露于病毒的相关检疫和生物安全措施仍十分有限。已有多项研究表明,骆驼（尤其是单峰驼）不仅是人感染MERS-CoV的主要来源,并且是MERS-CoVs维持及多样化的重要宿主。WHO在其发布的《MERS疫苗目标产品特性》指南中指出,对单峰驼这一重要宿主动物进行免疫的兽用疫苗策略可能是阻止人类MERS疫情暴发的最佳方式,同时可能是更快的疫苗开发及获批的方式,因此积极研制安全、有效的MERS兽用疫苗,对疫情的源头防控意义重大。此外,中亚作为“一带一路”的重要桥梁,MERS的防控和疫苗关键技术产品研发将有助于促进我国和“一带一路”沿线国家共同开展传染病防控,提升我国国际地位。为此,本文开展了MERS DNA疫苗和重组狂犬病病毒载体疫苗的构建与实验免疫研究。1.MERS DNA疫苗的构建与免疫原性评价MERS-CoV的刺突蛋白（Spike Protein,S）是病毒的主要免疫原,已成为疫苗研究的主要靶点。本研究构建表达不同长度MERS-CoV S蛋白基因的重组质粒并进行免疫原性比较,为MERS基因工程疫苗的研发提供有价值的参考。本部分实验将MERS-CoV S基因全长、SΔCD基因和S1基因分别克隆至pcDNA3.1真核表达载体,构建编码MERS-CoV S蛋白不同亚单位的三种DNA疫苗,并进行大量提取制备。分别将制备的重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot分析哺乳动物细胞中目的蛋白的瞬时表达情况。将三种DNA疫苗分别以肌肉注射的方式免疫小鼠,根据免疫后血清抗MERS-CoV IgG抗体效价筛选出效果最佳的DNA疫苗。用筛选出的DNA疫苗免疫小鼠进行免疫原性评价,测定经该DNA疫苗免疫后,机体所产生的针对MERS-CoV的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平;在转导hDPP4受体的小鼠模型中进行攻毒保护实验。结果表明,构建的三种重组质粒可在哺乳动物细胞中成功表达S蛋白、SΔCD蛋白和S1蛋白,并且S1蛋白的瞬时表达量最高。将pcDNA3.1-S、pcDNA3.1-SΔCD和pcDNA3.1-S1 DNA疫苗分别免疫小鼠,其中pcDNA3.1-S1组DNA疫苗免疫组血清抗MERS-CoV IgG抗体效价最高（文章发表在Vaccine杂志上）,这是首个关于编码不同长度S蛋白基因的MERS DNA疫苗的构建与免疫原性比较的研究报道。pcDNA3.1-S1 DNA疫苗的免疫原性实验结果显示,pcDNA3.1-S1 DNA疫苗免疫可诱导机体产生高水平的抗MERS-CoV中和抗体,EC50大于1:10 000;产生显著增强的CD8⁺和CD4⁺T淋巴细胞免疫应答和显著增多的INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10等细胞因子分泌;激发Th1型细胞免疫和Th2型体液免疫均衡的免疫应答;接种pcDNA3.1-S1 DNA疫苗或被动免疫200μL三免后一周免疫血清均有助于加速感染MERS-CoV的hDPP4转导小鼠肺内病毒的清除。上述实验结果表明,pcDNA3.1-S1 DNA疫苗具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生MERS-CoV特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答,并且能够提供攻毒保护效力。本部分实验内容提示,MERS-CoV S1蛋白基因片段短,在哺乳动物细胞内表达量高,免疫原性好,可作为MERS疫苗研发的有效靶点,为构建以狂犬病病毒为载体的重组疫苗时目的基因的选用提供了实验依据。2.表达MERS-CoV S1蛋白的重组狂犬病病毒的构建与鉴定基于狂犬病病毒（Rabies Virus,RABV）载体的重组病毒具有病毒产量高、易于大量制备、外源蛋白表达水平高等优点,拯救获得的重组病毒能够作为疫苗候选株。本实验基于RABV弱毒SRV9株的反向遗传操作系统,构建包含MERS-CoV S1蛋白基因的重组狂犬病病毒感染性克隆,与RABV的辅助质粒pcDNA3.1-RABV_N、pcDNA3.1-RABV_P、pcDNA3.1-RABV_L和pcDNA3.1-RABV_G共转染BSR细胞拯救重组病毒rSRV9-MERS_S1,从基因组和蛋白两方面鉴定外源基因的插入及表达情况,并通过体内和体外实验研究rSRV9-MERS_S1的生长动力学、遗传稳定性和神经毒性等特性。直接免疫荧光结果显示阳性,电镜下可见具有典型狂犬病病毒形态特征的弹状病毒粒子;RT-PCR结果表明,MERS-CoV S1蛋白基因成功插入到重组病毒的基因组中,且插入的外源基因在传代过程中遗传稳定;间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western Blot分析均显示,MERS-CoV S1蛋白在rSRV9-MERS_S1中得到成功表达;免疫电镜结果表明,RABV G蛋白和MERS-CoV S蛋白在重组病毒粒子表面同时嵌合存在,外源蛋白为组成性表达,为进一步将rSRV9-MERS_S1灭活使用奠定了基础;生长曲线显示重组病毒rSRV9-MERS_S1与母本病毒rSRV9的生长动力学无显著差异,rSRV9-MERS_S1的最高滴度可达2×10⁸.5.5 TCID₅₀/mL;乳鼠及成鼠颅内攻毒结果显示,重组病毒rSRV9-MERS_S1的神经毒性较母本病毒rSRV9降低。本部分实验内容表明,成功构建了表达MERS-CoV S1蛋白的重组RABV感染性克隆pD-SRV9-PM-MERS_S1,拯救出的rSRV9-MERS_S1重组病毒遗传稳定、病毒滴度高,MERS-CoV S1蛋白成功嵌合至重组病毒粒子中,该重组病毒可作为疫苗候选株用于进一步的实验免疫研究。3.MERS-CoV重组狂犬病病毒载体疫苗的实验免疫研究研制安全有效的新型骆驼MERS疫苗,对阻断病毒的传播、降低人类的感染风险具有重要意义。本实验基于已拯救获得的rSRV9-MERS_S1重组病毒制备MERS-CoV重组狂犬病病毒疫苗,通过在小鼠上开展不同疫苗形式（活疫苗、灭活疫苗）、不同免疫次数（一次免疫、两次免疫）的免疫原性比较研究,最终确定该重组病毒载体疫苗的使用形式为灭活病毒、两次免疫。以制备的rSRV9-MERS_S1灭活疫苗作为免疫原,分别对小鼠、羊驼、骆驼等动物进行免疫,探究免疫小鼠血清抗MERS-CoV IgG抗体的消长规律、抗体持续期,中和抗体水平和特异性T细胞免疫应答情况,评估羊驼和骆驼免疫后血清中抗MERS-CoV的中和抗体及抗RABV的中和抗体水平。结果表明,免疫该灭活疫苗后,小鼠血清抗MERS-CoV IgG抗体水平于首次免疫后5周达到峰值,免疫10个月后仍能够检测到抗体;小鼠血清对人MERS-CoV KOR/HIN株及单峰驼MERS-CoV D1271株假病毒具有交叉中和能力;诱导机体产生显著增强的MERS-CoV特异性CD8⁺T细胞应答。羊驼及骆驼免疫后,体内均可产生对人MERS-CoV流行株和单峰驼MERS-CoV流行株有交叉中和能力的高滴度抗MERS-CoV中和抗体;产生高滴度抗RABV中和抗体,加强免疫后羊驼和骆驼血清抗RABV中和抗体效价均高于0.5IU/mL,达到WHO狂犬病专家委员会和世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health,OIE）规定的有效抵抗RABV感染的指标。本部分实验结果表明,制备的基于狂犬病病毒载体的rSRV9-MERS_S1灭活疫苗能够诱导特异性体液免疫应答和T细胞免疫应答的产生,可为骆驼MERS防控提供新的物质与技术储备。4.联合免疫策略对MERS疫苗免疫效果的影响多项研究表明,相较于同种疫苗反复注射的免疫策略,联合免疫策略能够诱导机体产生高水平记忆T细胞,显著提高免疫效力,在抗感染免疫中起到良好效果。为了优化MERS疫苗免疫策略,本实验以已制备的pcDNA3.1-S1 DNA疫苗进行首次免疫,以制备的基于狂犬病病毒载体的rSRV9-MERS_S1灭活疫苗进行加强免疫,与上述两种疫苗采用同种疫苗加强免疫策略时的免疫效果进行比较,评估异种疫苗prime-boost加强免疫策略对疫苗免疫效果的影响。此外,为了简化疫苗的使用方式,本实验将DNA疫苗与rSRV9-MERS_S1灭活疫苗混合后免疫小鼠,与上述两种疫苗单独使用时的免疫效果进行比较,探究混合接种的免疫方式对机体免疫应答水平的影响。通过上述实验,检测机体产生的MERS-CoV特异性体液免疫应答和细胞免疫应答水平,评价两种疫苗联合应用后对MERS疫苗免疫效果的影响。结果显示,与DNA疫苗及rSRV9-MERS_S1灭活疫苗同种疫苗加强免疫策略相比,经异种疫苗prime-boost加强免疫的小鼠,血清抗MERS-CoV中和抗体滴度显著升高;无论是处于T细胞活化期还是记忆期,抗原特异性CD8⁺T细胞免疫应答均显著增强。此外,采用混合接种的免疫方式后,与DNA疫苗和rSRV9-MERS_S1灭活疫苗免疫组相比,混合接种组小鼠血清抗MERS-CoV IgG抗体水平升高,中和抗体滴度、活化期和记忆期MERS-CoV特异性CD8⁺T免疫应答均显著提升。本部分实验内容表明,基于MERS DNA疫苗及rSRV9-MERS_S1灭活疫苗的联合免疫策略能够提升疫苗的免疫效果,为未来MERS疫苗免疫策略的制定提供了实验依据,同时为研制新型“低成本-高效”MERS疫苗提供了新思路。