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低温热疗作为一种新型的肿瘤治疗方式,在光热治疗（PTT）的基础上降低温度（<45℃）,从而减少高温对正常组织的创伤。但受限于低温的治疗效果,单独应用除易致肿瘤细胞产生耐热性之外,对光热剂在肿瘤部位的渗透和蓄积以及外源性光刺激的穿透性也有较高要求。为此,本文开发了一种多功能水凝胶,利用中药昆布的有效成分海藻酸钠（ALG）为载体,封装光热材料油墨（Ink）和自由基引发剂（AIPH）,局部注射后通过近红外二区激光照射产生低温刺激,触发引发剂分解产生烷基自由基,有效诱导肿瘤细胞凋亡。此外,凝胶在体内表现出较强的固定能力,有效延长了药物作用时间。这一策略不仅能够克服肿瘤低温热疗的局限,而且对拓展癌症光学治疗在临床上的应用具有重要意义。研究目的:利用ALG与Ca2+配位交联机理初步构建水凝胶载体系统,封装Ink与AIPH后,通过体外实验探究水凝胶的光热效应及自由基产生能力;将多功能水凝胶应用于结肠癌模型,评价其对肿瘤细胞的协同光热治疗效果,并探讨多功能水凝胶抗肿瘤的作用机理。方法:1.制备AIPH+Ink+ALG多功能水凝胶,利用扫描电子显微镜、动态光散射粒径仪和红外光谱扫描评价凝胶的形貌及表征;研究不同浓度ALG的成胶特性并用紫外光谱扫描实验评价包封药物缓释效果;红外热成像实验监测激光照射后多功能水凝胶的光热效应及光热稳定性;利用ABTS检测剂和亚甲基蓝脱色实验评价多功能水凝胶的自由基产生能力;使用DCFH-DA荧光探针检测凝胶作用于HCT-116细胞后的自由基生成情况。2.体外选择HCT-116和293T细胞系用CCK-8法测定AIPH+Ink+ALG多功能水凝胶在无激光照射下的生物安全性;CCK-8法评价含不同浓度AIPH和Ink的多功能水凝胶体外协同光热治疗后的抗肿瘤活性;通过Calcein-AM/PI染色共聚焦显微镜观察和Annexin V-FITC/PI染色流式细胞定量分析以及线粒体膜电位检测实验评价多功能水凝胶在激光照射后对结肠癌细胞凋亡的影响;采用脂质组学LC-MS平台分析探究多功能水凝胶抗肿瘤的作用机理。3.结肠癌裸鼠模型的建立、标本收集及相关指标的测定;通过高分辨光声成像系统监测水凝胶瘤内注射裸鼠后的成胶固定情况;HCT-116荷瘤裸鼠随机分为6组,以小鼠体重、肿瘤体积变化等情况监测功能凝胶协同光热的体内治疗效果;通过苏木精、伊红（H&E）染色和TUNEL免疫荧光染色实验研究肿瘤组织的病理变化;制作肿瘤组织冷冻切片进行DCFH-DA/DAPI染色,研究瘤体内的自由基含量变化情况;通过免疫组化实验探究治疗后各脏器组织的病理变化,评价多功能水凝胶的体内毒性。结果:1.⑴通过材料表征实验观察到大量的Ink纳米粒聚集在凝胶表面,且AIPH+Ink+ALG的红外吸收光谱在360 nm处有较强吸收峰与AIPH相似,其余波段与Ink几乎相同,表明通过ALG与Ca2+的交联作用可以有效地将AIPH和Ink封装入水凝胶中;⑵成胶实验表明当ALG浓度超过5 mg/m L时,注入Ca2+溶液后可以快速成胶,遂采取此浓度用于后续实验;⑶AIPH+Ink+ALG恒温振荡24 h后,释放的AIPH和Ink几乎无UV-Vis吸收,因此ALG水凝胶可被用作药物缓释载体;⑷功能凝胶的光热效应评价中,封装有25μg/m L Ink的多功能水凝胶经1064nm激光照射10 min后温度可升至44℃,且5次反复照射下光热稳定性良好,以达到低温热疗的目的;⑸用ABTS检测剂评价AIPH分解产生自由基的能力,发现ABTS+·在44℃时的吸光度明显高于37℃,说明AIPH在较高温度下分解速率更快;⑹AIPH+Ink+ALG功能凝胶在激光照射10 min后与ABTS孵育产生的ABTS+·达到峰值,与MB孵育后的褪色率也达到47.2%,均说明多功能水凝胶在激光照射后可分解产生大量自由基;⑺检测HCT-116细胞中ROS的表达,发现AIPH+Ink+laser和AIPH+Ink+ALG+laser组出现较强的绿色荧光信号,推断功能凝胶对肿瘤细胞有良好的抑制作用。2.⑴CCK-8法测定多功能水凝胶各成分对HCT-116和293T两种细胞系均无较明显的细胞毒性;⑵在HCT-116细胞中评价多功能凝胶的体外光热协同治疗效果,1064 nm激光照射后低温治疗组细胞存活率为73.6%,而功能凝胶组存活率降低至19.8%;⑶细胞凋亡共聚焦定性评价显示AIPH+Ink+laser和AIPH+Ink+ALG+laser组显示出了强烈的红光;⑷流式定量结果显示两组的凋亡率分别为44.38%和45.0%,;⑸JC-1染色实验观测到红色荧光转为绿色,提示线粒体膜电位的降低,与其他组别相比均有显著差异,以上结果都进一步的证实了NIR-II激光照射引起的Ink低温光热效应触发了AIPH生成大量自由基有效诱导了癌细胞的凋亡;⑹采用LC-MS脂质组学平台探究有无自由基参与后细胞脂质水平的变化,共检测到14类脂质分子,筛选出99种差异脂质做层次聚类分析,发现与Ink+laser组相比,AIPH+Ink+laser组中多不饱和脂肪酸含量明显降低,且脂代谢产物变化趋势相似,由此得出AIPH受热后产生细胞毒性的机制与自由基介导的脂质损伤相关。3.⑴以Ink作为造影剂,在光声成像实验中发现ALG水凝胶注射入小鼠体内24 h后PA信号强度仍有0.907,具有较强的固定能力;⑵在皮下肿瘤模型中,也可以直观地看出ALG在肿瘤内形成凝胶后有效减少了药物的泄露;⑶红外热成像仪监测药物瘤内注射入荷瘤小鼠体内后AIPH+Ink+ALG+laser组五分钟后迅速升温至44.9℃,体内光热效应良好;⑷瘤内自由基检测实验发现AIPH+Ink+ALG+laser组肿瘤切片显示出较强的DCF荧光信号,证明AIPH受热分解产生自由基可显著增强瘤内的氧化应激;⑸HCT-116皮下瘤模型药效学评价表明,AIPH+Ink+ALG+laser组肿瘤抑制率达到88.24%,免疫组化和免疫荧光实验均观察到多功能水凝胶治疗组肿瘤细胞凋亡最为明显,显示出优越的体内光热协同治疗效果;⑹裸鼠治疗期间体重变化无明显差异,主要脏器病理学改变不明显,表明功能凝胶具有良好的生物相容性。结论:1.本课题开发了一种多功能注射凝胶系统,以中药昆布的有效成分海藻酸钠为载体,封装近红外二区光热材料油墨和可通过热降解的偶氮类引发剂,在驱动低温热疗的同时,催生大量自由基协同杀伤肿瘤。2.我们通过体外诱导癌细胞脂质氧化,在体内不发生肿瘤复发的情况下完全根除肿瘤,证实了协同治疗的有效性。3.同时水凝胶在体内外均表现出较强的固定能力,有效延长了药物作用时间。4.该凝胶还能产生强烈的光声信号,用于监测凝胶的稳定性。5.系统的毒性评价也证明了该策略具有较高的生物安全性和生物相容性。