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目的：MicroRNA（miRNA）是一类22nt的非编码RNA，主要通过严格或不严格碱基配对机制结合到所调控靶基因mRNA的3’UTR（3’untranslational region）区，从而干扰mRNA稳定性以及蛋白的转录过程，发挥其对基因表达的负调控作用。我们前期研究发现miR-486-5p是人非小细胞肺癌（Non-Small-Cell Lung Cancer，NSCLC）中最显著低表达的miRNA之一，其在痰液和外周血中表达的变化对于NSCLC早期诊断具有重要临床价值。此外，我们研究发现miR-486-5p在肺癌中的作用为抑癌基因，它的低表达促进肺癌的形成及进展过程，但是目前其作用机制尚不完全明了。本研究拟在前期研究基础上，进一步探讨miR-486-5p作用的靶基因，为揭示其在NSCLC中的作用机制奠定基础。方法：首先利用生物软件对miR-486-5p作用的靶基因进行预测，之后通过构建含有Pim-1mRNA3’-UTR区的报告基因载体，利用双荧光素酶报告基因方法检测miR-486-5p对Pim-1的调控作用。在此基础上，在筛选获得的稳定表达miR-486-5p的细胞株中，利用Western Blot和Real-time PCR方法检测细胞中Pim-1的表达情况。进一步在24对人NSCLC肿瘤组织及配对的正常肺组织中检测miR-486-5p和Pim-1的表达情况。通过上述实验，观察miR-486-5p对Pim-1表达的调控作用。结果：1生物软件预测Pim-1可能为miR-486-5p作用的靶基因我们利用miRNA靶基因预测软件miRecords及miRsearch对miR-486-5p所作用的靶基因进行了分析。预测结果表明，在所有32853个预测基因中，Pim-1位列第24位。反过来，对可能结合于Pim-1mRNA3’-UTR区的miRNAs进行预测，表明miR-486-5p位于前10位。综合结果提示Pim-1可能是miR-486-5p调控的靶基因之一。2构建Pim-1-3’-UTR报告基因载体根据上述预测结果，将包含主要预测位点在内的1200-bpPim-1-3’-UTR区域，通过PCR扩增构建Pim-1-3’-UTR报告基因载体（pGL3-Pim-1）。根据酶切结果筛选出阳性克隆，进一步提取阳性克隆的质粒进行测序，结果证实序列与GenBank（NM002648.3）提供的碱基序列完全一致，pGL3-Pim-1报告基因载体构建正确。3双荧光素酶报告基因检测miR-486-5p对Pim-1的调控作用与对照组相比，实验组细胞中Pim-1-3’-UTR荧光素酶活性降低了大约70%，结果表明miR-486-5p可以直接结合于Pim-1mRNA的3’-UTR区，从而调控其表达。4筛选获得稳定表达miR-486-5p细胞株细胞转染miR-486-5p真核表达载体后经嘌呤霉素筛选，我们在H1299、H157以及A549细胞中分别获得了相应的细胞克隆。经TaqmanmicroRNA assay检测表明，与对照细胞相比，稳定转染miR-486-5p的细胞株中均可见miR-486-5p显著高表达，结果证实我们筛选获得了稳定表达miR-486-5p细胞株。5Pim-1在稳定表达miR-486-5p细胞株中的表达情况Western Blot检测结果表明，与对照细胞相比，过表达miR-486-5p的细胞中Pim-1蛋白的表达显著降低，而Pim-1mRNA的表达水平在稳定表达miR-486-5p细胞株中无显著变化。结果提示miR-486-5p过表达在转录后水平抑制Pim-1的表达。6miR-486及Pim-1在人NSCLC肿瘤以及匹配的肺组织中的表达为了进一步验证miR-486-5p与Pim-1的表达情况，我们在24例新鲜冻存的人NSCLC肿瘤组织及其匹配的正常肺组织中检测了Pim-1蛋白以及miR-486-5p的表达情况。检测结果表明，miR-486-5p在87.5%（21/24）的肿瘤组织中均显著低于其匹配的正常肺组织中的表达水平。Pim-1蛋白的表达在87.5%（21/24）的肿瘤组织中均显著高于其匹配的正常肺组织中的表达。进一步经Wilcoxon配对资料秩和检验证实，24例肿瘤组织中miR-486-5p表达水平显著低于正常肺组织的表达（Z=-3.971, P=.000），而Pim-1蛋白表达显著高于正常肺组织的表达（Z=-4.257, P=.000）。此外，我们进一步在5个NSCLC细胞株A549、H1299、H157、SK-MES-1和H358中对miR-486-5p与Pim-1表达进行了检测。以24例正常肺组织中miR-486-5p表达水平为参照，可见在上述五个细胞中miR-486-5p水平均显著低于正常肺组织，但是在各个细胞中均可见Pim-1蛋白表达。结论：1MiR-486-5p在非小细胞肺癌组织中的表达显著低于匹配的正常肺组织，常表现为低表达状态。2Pim-1为miR-486-5p调控的靶基因，miR-486-5p可在转录后水平负性调节Pim-1的表达。3MiR-486-5p低表达是引起Pim-1在NSCLC过表达的机制之一，也是miR-486-5p参与肺癌发生发展的通路之一。