【摘 要】
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表皮生长因子受体(EGFR),在多数实体瘤中广泛存在,因其过表达与实体瘤的生长以及转移密切相关,被称为癌症的必需生物标志物。西妥昔单抗为应用最广泛的EGFR抗体,与几种同是治
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表皮生长因子受体(EGFR),在多数实体瘤中广泛存在,因其过表达与实体瘤的生长以及转移密切相关,被称为癌症的必需生物标志物。西妥昔单抗为应用最广泛的EGFR抗体,与几种同是治疗结直肠癌以及头颈癌等与EGFR过表达有关癌症的抗体,均因尺寸大这一弊端大大影响了其在临床应用中的治疗效率。人源化单链抗体(huscFv)显著的优点就是分子量小,具有较强的穿透力,因其人源化还可以消除一部分鼠抗的免疫原性。本课题以EGFR抗体西妥昔单抗为基础,在其结构上选取VH和VL片段以短肽链Linker连接为单链抗体主要结构,选取实验室已研究出的成熟的抗肿瘤多肽ZXR-2,以Linker连接,设计并合成了 EGFR与抗肿瘤肽ZXR-2融合的蛋白(huscFv-ZXR-2)的氨基酸序列,并反向翻译得到核苷酸序列,对于序列进行人源化优化,使得蛋白可以在大肠杆菌中表达,以未连接ZXR-2的人源化单链抗体huscFv为对照。通过基因工程的方法对这两个片段进行酶切,连接,诱导表达以及纯化,并对诱导表达以及纯化过程中的操作参数进行优化筛选,获得蛋白表达量以及纯度最高的实验参数。然后优化蛋白的复性条件以提高蛋白表达的回收率。运用Western blot检测表达蛋白的特异性。对蛋白进行ELISA实验检测抗原抗体结合活性,通过细胞生长抑制实验检测蛋白对于不同EGFR表达量细胞的生长抑制程度。结果表明huscFv-ZXR-2和huscFv两个重组载体均已构建成功,并在大肠杆菌中成功表达,诱导后的蛋白均以包涵体形式存在,表达量最高的诱导条件是16℃,时间12h。通过对比盐酸胍和尿素对包涵体的变性处理以及Ni-NTA柱和Co-NTA柱两种不同层析柱的纯化效果,结果表明尿素变性条件下Ni-NTA柱的纯化效果更好。后期复性过程中,尿素浓度为2M,进行梯度透析后的蛋白纯度以及产率都较高。ELISA实验结果表明huscFv-ZXR-2和huscFv两个蛋白均可特异性结合EGFR,huscFv-ZXR-2的结合量更高。细胞毒性实验结果显示两个表达蛋白均对于不同细胞的抑制作用与EGFR的表达量成正比,huscFv-ZXR-2则表现出更强的抑制作用。总之,本研究筛选出了最适合两种蛋白的表达纯化参数,且两种蛋白均对于EGFR有特异性结合的效果,带有抗肿瘤多肽的蛋白作用效果更明显。
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