论文部分内容阅读
肺癌是严重危害人类健康的疾病之一,其死亡率居恶性肿瘤第一位。肺癌分为小细胞肺癌(small lung cancer, SCLC)与非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)两大类,其中非小细胞肺癌中最常见的是肺腺癌、肺鳞癌和肺大细胞癌三个亚型。microRNA是一类小的约22个核苷酸的非编码RNA,在进化上十分保守,通常作为基因表达的负调控子起作用。研究发现microRNA在人类不同类型肿瘤中表达异常或者发生突变,表明它们有可能作为一类新的原癌基因或者肿瘤抑制基因起作用。miRNA通常成簇存在于染色体上形成一个家族,迄今为止,除了少数报道,对microRNA家族在肿瘤中的作用仍然知之甚少。在本研究中,我们研究了miR-132/212家族在非小细胞肺癌细胞中的作用及其调控机制。我们首先利用microRNA表达谱芯片研究了TPA刺激非小细胞肺癌细胞系A549的microRNAs表达变化,发现相比于对照细胞,许多microRNAs在受到TPA处理之后表达改变,包括miR-132/212家族的两个成员,miR-132和miR-212。为了排除芯片结果的假阳性,我们利用定量PCR检测了TPA处理的A549, H1299和BEAs-2B细胞中的miR-132和miR-212,发现TPA刺激诱导了miR-132和miR-212的高表达,这与芯片结果一致。随后我们研究了miR-132和miR-212在非小细胞肺癌细胞中的作用。在非小细胞肺癌细胞中通过瞬时转染和稳定表达miR-132和miR-212,我们发现过表达miR-132或miR-212加快了细胞增殖速度,改变了细胞周期进程,增强了细胞粘附非依赖生长的能力,促进了细胞侵袭和转移,且它们的促进效应可以被它们各自的抑制剂anti-miR-132或anti-miR-212所逆转,这些结果表明在NSCLC中,miR-132和miR-212表现出原癌基因的性质。MiR-132和miR-212属于miR-132/212家族,位于染色体17p13.3,在染色体上相距263bp。为了研究miR-132/212家族成员之间的作用关系,我们首先利用反转录PCR证明了miR-132和miR-212来源于同一个转录本。我们在H1299细胞中筛选了同时稳定表达miR-132和miR-212(miR-T)的稳定细胞株,命名为‘’H1299-pEGP-miR-T",不表达任何miRNA只表达GFP的对照细胞命名为‘’H1299-pEGP-miR-null",然后检测了过表达miR-T对NSCLC细胞功能的影响,发现与对照相比,同时过表达miR-132和miR-212加快了细胞增殖速度,但是抑制了细胞粘附非依赖性生长的能力,细胞侵袭和转移的能力降低；有意思的是,在H1299-pEGP-miR-T细胞中,用anti-miR-132或anti-miR-212消减掉miR-132或miR-212某一个的过表达,miR-T对细胞侵袭和转移的抑制作用被逆转,这些结果暗示了过表达miR-132和miR-212的强度有可能会对细胞侵袭和转移有不同的影响。为了研究miR-132/212家族在NSCLC中的调控机制,利用生物信息学方法,我们预测了miR-132/212的靶基因,发现Hedgehog信号通路受体PTCH1是一个潜在的靶基因。Hedgehog通路是一个十分重要的细胞间信号通路,在两侧对称动物的发育过程中,控制大多数的细胞命运决定。分泌的Hh分子(Shh,Dhh,andIhh)与受体(Hip1, PTCH1, and PTCH2)结合,使另外一个跨膜蛋白Smo活化。Smo启始一系列的级联反应,导致Glil从细胞质进入细胞核,作为转录因子起作用。利用双荧光检测、定量PCR和western blot,我们证明了PTCH1是miR-132和miR-212的一个共同的靶基因。利用RNA干扰技术,我们发现在A549、H1299和BEAs-2B细胞中用PTCH1siRNA消减PTCH1表达加快了细胞增殖速度,这与PTCH1受到miR-132和miR-212的负调控之后的作用一致,暗示了miR-132/212家族促进细胞增殖的作用依赖于它们对PTCH1的调控。然而,在上面三种细胞中,PTCH1siRNA减少了PTCH1表达之后抑制了细胞侵袭和转移,这与PTCH1被miR-132或miR-212所抑制的作用相反,与miR-T的作用一致,暗示了PTCH1并非是介导miR-132/212家族在肿瘤侵袭和转移方面的靶基因。我们证明了Hedgehog信号通路另外两个成员HHIPl和SUFU也可能是miR-132/212的靶基因。PTCH1、HHIP1和SUFU都是hedgehog通路的负调节因子,因此我们检测了miR-132/212家族过表达对hedgehog信号通路活性的影响,发现抑制miR-132/212家族表达能够降低hedgehog通路活性。总之,我们证明了在NSCLC细胞中,miR-132和miR-212能够加快细胞增殖,增强细胞粘附非依赖生长的能力,促进细胞侵袭和转移,表现出原癌基因的作用；PTCH1是miR-132/212的一个共同靶基因,miR-132/212家族在NSCLC中的作用部分依赖于对PTCH1的调控；miR-132/212家族可能影响hedgehog信号通路活性。