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研究背景:心肌能量代谢参与心力衰竭的发生与发展,能量代谢成为近年来心力衰竭的研究热点。过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1 alpha,PGC-1α）是一种核受体的辅激活因子,与线粒体密切相关,它能与多种核受体结合,在能量代谢中发挥重要作用。目前,PGC-1α的研究众多,但研究结果存在诸多矛盾与争议,这可能与其治疗窗窄,亚型繁多,难以精确调控有关。NT-PGC-1α（N-terminal truncated PGC-1αα）是一种截短的 PGC-1α 异构体,主要分布于细胞浆,仅含N端的270个氨基酸,保留PGC-1α部分功能序列,有可能避免过度激活核呼吸因子。因此,NT-PGC-1α有望作为治疗心力衰竭的靶点。综上,我们提出了如下的科学假设:NT-PGC-1α具有改善能量代谢的作用,其机制可能是通过NT-PGC-1α穿梭至细胞核中,与核受体结合,激活相关信号通路,改善心功能。目的:检测NT-PGC-1α在心力衰竭小鼠模型中的变化,研究过表达NT-PGC-1α对心肌能量代谢的影响及其机制,探索CRM1抑制剂Selinexor对NT-PGC-1α的调节作用及其应用。方法:本研究分四部分进行,分别从（1）NT-PGC-1α在心梗后心衰小鼠模型中的变化;（2）NT-PGC-1α对线粒体能量代谢的作用;（3）利用核定位序列（NLS）及CRM1通路调节NT-PGC-1α进入细胞核;（4）CRM1抑制剂在心梗后心衰小鼠模型中的应用等方面进行研究。拟建立体内、体外心衰模型,利用多种生物学技术,探索NT-PGC-1α对心肌能量代谢的影响及其调节机制。具体方案如下:1.构建心梗后心衰小鼠模型,超声心动图检测心功能,qPCR、Western Blotting及IHC检测PGC-1α、NT-PGC-1α以及其相关因子mRNA、蛋白水平。2.分离胞浆胞核蛋白,检测PGC-1α与NT-PGC-1α亚细胞分布。免疫荧光检测PGC-1α、mCherry-NT-PGC-1αα亚细胞分布。3.NRCMs在过表达NT-PGC-1α或给予空载病毒后,给予苯肾上腺素（phenylephrine,PE）或血管紧张素 Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,AngⅡ）刺激,检测细胞内ATP、ROS生成和线粒体膜电位。利用CO-IP技术探索细胞浆中NT-PGC-1αα的蛋白相互作用。WB检测过表达NT-PGC-1α在PE诱导的心衰中的作用。检测过表达NT-PGC-1α对脂滴沉积及细胞外氧耗的影响。4.过表达NT-PGC-1α,qPCR检测下游基因水平。CCK8试验检测Selinexor药物毒性。构建Adenovirus-mCherry-NT-PGC-1α及融合NLS序列的Adenovirus-mCherry-NT-PGC-1α,转染病毒后,给予CRM1 抑制剂Selinexor刺激,共聚焦显微镜观察NT-PGC-1 α分布。利用qPCR检测NT-PGC-1 α入核后相关mRNA的表达。5.利用鬼笔环肽染色及WB验证Selinexor抗心肌肥厚的作用。在野生型小鼠及FL-PGC-1α（-/-）小鼠心梗后心衰模型中,给予CRM1抑制剂Selinexor灌胃,术后1周、4周行超声心动图检查,检测心重、体重及胫骨长度,并进行生存分析,检测相关mRNA变化。通过WB检测及组蛋白H3乙酰化检测试剂检测Selinexor及TSA在组蛋白乙酰化中的作用。结果:1.NT-PGC-1α在心梗后心衰小鼠模型中的改变:WB检测显示心梗后心衰小鼠模型的心肌组织中PGC-1α、NT-PGC-1α以及脂肪酸代谢相关蛋白表达明显降低。2.NT-PGC-1α在心肌中的分布及其对心肌线粒体功能的影响:胞核胞浆分离及免疫荧光显示,PGC-1α主要分布于细胞核,NT-PGC-1α主要分布于细胞浆;在Ang Ⅱ或PE刺激下细胞ATP水平下降,而过表达NT-PGC-1α能减轻这种降低;过表达NT-PGC-1α能够减轻PE诱导的线粒体膜电位（JC-1）下降和氧自由基（Reαctive oxygen species,ROS）生成;NT-PGC-1α 能上调 PPAR-α 相关蛋白Acαdm、CPT2的表达,减轻PE对PPAR-α通路的抑制作用;过表达NT-PGC-1α能够减少脂性培养基中心肌细胞的脂滴数目,还能增加细胞外氧耗。3.过表达NT-PGC-1α对下游基因表达的影响,以及CRM1抑制剂对NT-PGC-1α和心肌组织的作用:Selinexor及NLS序列能够增加NT-PGC-1α细胞核内的分布;Selinexor抑制PE诱导的p-MHC蛋白表达增多及细胞肥厚;Selinexor及NLS序列的应用能促进NT-PGC-1 α细胞中相关通路mRNA的表达。4.CRM1抑制剂Selinexor在心梗后心衰小鼠模型中的应用:Selinexor不能改善WT小鼠和FL-PGC-1α（-/-）小鼠生存率及心功能;在未过表达NT-PGC-1α的细胞中,增加Selinexor浓度并没有增加下游基因的表达。结论:1.小鼠心梗后心衰模型PGC-1α、NT-PGC-1α、脂肪酸代谢相关蛋白及SOD2表达降低,提示了 NT-PGC-1α可能在脂肪酸代谢和抗氧化应激中发挥作用;2.NT-PGC-1α在心肌细胞中的分布主要是在细胞浆,PGC-1α在心肌细胞中的分布主要是在细胞核;3.过表达NT-PGC-1α能够减少AngⅡ和PE诱导的ATP含量降低、减少PE诱导的线粒体膜电位下降、减少PE诱导的活性氧生成;4.过表达NT-PGC-1α能够辅激活PPAR-αα相关通路增强脂肪酸代谢;5.过表达NT-PGC-1α能够增加细胞外氧耗,减少细胞内脂滴的沉积;6.应用Se1inexor及融合表达NLS,能促进过表达的NT-PGC-1α在细胞核的分布,并激活相关信号通路;7.Selinexor具有抑制心肌细胞肥厚的作用;8.未过表达NT-PGC-1α时,单独应用Selinexor不能激活NT-PGC-1α相关信号通路。