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非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是病理改变与酒精性肝病相似但无过量饮酒史的临床病理综合征,其疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、脂肪性肝纤维化/肝硬化,甚至并发肝癌,严重威胁人类健康。近年我国NAFLD的发病率呈逐渐上升趋势,NASH作为单纯脂肪肝向非酒精性肝纤维化发展的必经阶段,其发病机制尚未完全清楚,因此亦缺乏有效的防治策略。脂联素由脂肪细胞分泌,是目前发现的唯一与血脂水平呈负相关的胶原样细胞因子,具有调节脂代谢、调节糖代谢、抗炎等作用。脂联素有两种受体:AdipoR1和AdipoR2,其中AdipoR2在肝脏中表达丰富,提示脂联素可能参与NASH发生发展过程。噻唑烷二酮类药物(罗格列酮)为特异性PPARγ激动剂,我们的前期研究发现其具有改善蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-choline deficient diet, MCD)饮食诱导的小鼠肝脂肪变、炎症及肝纤维化,但脂联素在此模型中的变化及其在NASH进展中的作用及机制尚不清楚。本研究采用MCD饮食建立小鼠NASH模型,以罗格列酮进行干预实验,探讨脂联素在NASH发病及进展中的作用及作用机制,为NAFLD的靶向性药物/基因治疗提供新的途径。目的:采用蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食建立小鼠NASH模型,应用罗格列酮进行干预治疗,观察脂联素、TNF-α、IL-6的表达变化与疾病进展的关系,以明确脂联素在NASH发病中的作用及作用机制,以及PPARγ激动剂调节脂联素表达、阻滞NASH进展的作用,为临床选择靶向性治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物或基因治疗提供理论依据。方法:选用8周龄健康雄性C57BL6/J小鼠30只,随机分为3组,每组10只。模型组采用MCD饲料,对照组给予胆碱、蛋氨酸充足的饲料,罗格列酮干预组应用MCD饲料加罗格列酮(50mg/kg/d),共喂养3周。血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT),甘油三酯(triglyceride, TG)采用日本Olympus AU 2700全自动生化分析仪测定;采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色及Masson染色观察肝组织病理学改变;肝组织脂联素表达采用免疫组织化学染色方法检测;TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达分别采用RT-PCR和Western blot检测。结果:1动物一般情况:对照组小鼠活泼、毛发有光泽,体重逐渐增加。模型组和罗格列酮干预组小鼠体重均下降,尤以模型组明显。对照组、模型组和干预组小鼠体重、肝湿重分别为:26.00±1.00 g、14.14±0.68 g、14.31±0.81 g,0.89±0.12 g、0.53±0.10 g、0.56±0.10 g。模型组、罗格列酮干预组小鼠体重、肝湿重较对照组明显下降(P值均<0.05),而罗格列酮干预组与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。对照组、模型组和干预组小鼠肝脏指数分别为:0.034±0.005、0.038±0.006、0.039±0.008,各组相比无统计学差异(P>0.05)。2血清生化学改变:对照组、模型组和干预组小鼠血清ALT、TG水平依次为:50.78±10.03 U/L、161.56±28.23 U/L、83.56±12.27 U/L;0.54±0.29 mmol/L、0.97±0.81 mmol/L、0.76±0.13 mmol/L。模型组小鼠血清ALT、TG均显著高于对照组(P<0.01),而罗格列酮干预后可明显降低ALT、TG水平(P<0.01)。3肝组织病理学变化:肉眼观察:对照组小鼠肝脏为红褐色,明亮有光泽。模型组小鼠肝脏体积明显减小,整个肝脏呈浅黄色,与周围组织有粘连,切面油腻、无光泽。罗格列酮干预组小鼠肝脏体积亦有缩小,为红褐色、有光泽。光镜观察:对照组小鼠肝脏肝小叶结构正常,肝板排列整齐;模型组肝细胞弥漫性水样变,呈现大泡性为主的肝细胞脂肪变,以腺泡3带明显,小叶内可见点状或灶状肝细胞坏死伴以单个核细胞为主的混合性炎细胞浸润,可见少量分叶核白细胞。汇管区及窦周纤维组织增生不明显(F2~3G2~3S0~1)。罗格列酮干预组小鼠肝损伤较模型组明显减轻,脂肪变肝细胞明显减少,炎症、坏死及纤维化程度明显减轻(F1G1~2S0~1)。4肝组织TNF-αmRNA的表达:与对照组相比,模型组TNF-αmRNA表达明显增强(0.82±0.17 vs. 1.26±0.33, P <0.05),而罗格列酮干预组表达较模型组减弱(1.26±0.33 vs. 0.94±0.14, P<0.05),差异具有统计学意义。5肝组织TNF-α蛋白水平表达情况:与对照组相比,模型组TNF-α蛋白表达明显增加(0.47±0.06 vs. 1.21±0.05, P<0.05),而罗格列酮干预组表达较模型组明显减少(1.21±0.05 vs. 0.83±0.03, P<0.05),差异具有统计学意义。6肝组织IL-6 mRNA表达情况:与对照组相比,模型组IL-6 mRNA表达显著增加(0.34±0.01 vs. 0.89±0.01, P<0.01),而罗格列酮干预组表达较模型组明显下降(0.89±0.01 vs. 0.57±0.03, P<0.05),差异具有统计学意义。7小鼠肝组织IL-6蛋白表达情况:与对照组相比,模型组IL-6蛋白表达显著增加(0.46±0.01 vs. 0.91±0.01, P <0.01),而罗格列酮干预组表达较模型组明显下降(0.91±0.01 vs. 0.79±0.02, P<0.05),差异具有统计学意义。8肝组织脂联素的表达变化:对照组小鼠肝组织脂联素在小叶中央静脉周围及窦内皮细胞有少量表达;与对照组相比,模型组肝脏脂联素表达明显增强,且多表达于脂肪变肝细胞胞浆、炎症细胞浸润区枯否细胞胞浆及窦内皮细胞胞浆中,(1.46±0.27 vs. 15.24±0.36, P<0.01);罗格列酮干预组脂联素阳性表达较模型组明显减少(15.24±0.36 vs. 9.46±0.74, P< 0.05),差异具有统计学意义。结论:1非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝组织中脂联素表达明显上调,并与TNF-α及IL-6表达呈一致趋势,提示在NASH小鼠肝脂肪变及炎症的发生及进展中,脂联素可能通过代偿性表达增加来拮抗炎性因子的表达,从而阻止疾病的进展。2罗格列酮可上调PPARγ基因的表达,进一步上调脂联素表达水平、抑制炎症因子TNF-α、IL-6的表达,从而延缓或阻止NASH的发生与进展。