二苯醚类除草剂降解菌的分离、鉴定及其降解机理的研究

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二苯醚类除草剂是较早在我国广泛应用的除草剂之一,常见的此类除草剂有氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、三氟羧草醚等。同其它农药一样,此类除草剂进入环境后对生物及生态环境会产生影响。本研究从长期受氟磺胺草醚污染的土壤中分离筛选到氟磺胺草醚降解菌ZB-1,根据表型特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性分析,将其鉴定为Lysinibacillus sp. ZB-1。菌株ZB-1在pH6.0-9.0范围内生长良好,当pH低于5.0菌株的生长明显受到抑制,最适pH值为6.0;最适生长温度为30℃;好氧性生长;ZB-1的最适生长NaCl浓度是1%,当NaCl浓度小于3%时,菌体生长良好;当NaCl浓度大于4%时,生长受到明显的抑制;在以葡萄糖为碳源,以有机氮为氮源的培养基中生长较好。菌株ZB-1能够以氟磺胺草醚为唯一碳源进行生长,经过七天的培养,降解率达到81.32%,且随着氟磺胺草醚起始浓度的升高而降低。菌株ZB-1降解此除草剂的最适温度为30℃运用LC-MS和GC技术研究了菌株ZB-1在以氟磺胺草醚为唯一碳源的液体培养基中代谢此除草剂时产生的代谢产物,在对代谢物结构的分析基础上推测了ZB-1降解氟磺胺草醚的代谢途径。结果表明菌株ZB-1在降解氟磺胺草醚时,首先,苯环上的硝基还原成氨基,然后氨基进一步乙酰化,同时苯环上发生脱氯作用,S-N键发生断裂。从长期受乳氟禾草灵污染的土壤中分离筛选到LY-2,根据表型特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性分析,将它鉴定为Brevundimonas sp. LY-2。降解菌株LY-2能够在5d内降解81.8%的浓度为50 mg/L的乳氟禾草灵。菌株LY-2降解乳氟禾草灵时,首先,苯环上链烷基的第一个和第二个酯键相继水解断裂,然后苯环上的硝基还原成氨基,再进一步乙酰化,同时苯环上发生脱氯作用,最后羧基和乙酰基还原成羟基。在实验室模拟条件下,应用ZB-1降解菌剂可以有效地降解土壤中氟磺胺草醚残留,为进一步实地修复实验提供了理论依据。建立了一种可定性检测乳氟禾草灵降解酶活力的新方法。通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和PAGE切胶回收电洗脱等纯化手段,将乳氟禾草灵酯酶纯化了113.3倍,酶的比活达到48.73 U·mg-1,最终得率为6.83%。最终得到一个分子量大约25 kDa的电泳纯乳氟禾草灵酯酶。分离纯化的乳氟禾草灵酯酶部分酶学特性如下:最适温度为20℃,最适pH为7.0,水解乳氟禾草灵的Km和Vmax为0.81μM and 1.26nmolmin-1mg-1。
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