人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)是一种酸性糖蛋白,含有127个氨基酸残基,其重组蛋白rhGM-CSF可以在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞中表达,rhGM-CSF分子量从14.4到32kDa不等。rhGM-CSF具有促进骨髓造血前体细胞增殖的作用,刺激粒细胞、单核细胞、巨噬细胞的集落形成和增生。该重组蛋白最初用于骨髓移植、肿瘤化疗及艾滋病相关的中性粒细胞缺乏症。目前,rhGM-CSF是以注射剂的形式应用于临床,有一定的局限性以及剂型引起的不良反应的风险。本实验室利用家蚕杆状病毒表达系统研制了重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(BmrhGM-CSF)口服胶囊,分子量为29kDa,临床前研究表明BmrhGM-CSF在体内外均具有生物学活性：在体外可以促进人骨髓干细胞集落形成；体内试验证明给小鼠、狗和猕猴灌胃BmrhGM-CSF后可以吸收入血并且发挥细胞因子的功能：(1)小鼠口服BmrhGM-CSF后,明显促进脾脏表面造血灶的形成和骨髓DNA的合成；(2)60Co辐照导致造血功能抑制的比格犬口服BmrhGM-CSF后第9天白细胞数目恢复到基值的50%,到第12天恢复到正常水平；(3)经环磷酰胺化疗的猕猴口服BmrhGM-CSF后,相对空白对照组,其白细胞的数量明显增加,其疗效与注射剂rhGM-CSF相似。基于上述工作的基础,本论文开展以下两部分研究：一是BmrhGM-CSF胶囊Ⅰ期临床试验,二是BmrhGM-CSF胶囊口服吸收机制的研究。一、BmrhGM-CSF胶囊Ⅰ期临床试验为探索BmrhGM-CSF胶囊单剂量用药安全性,选择健康受试者27例,分成5个剂量组：150μg、300μg、600μg、750μg、900μg,口服给药一次,按照剂量由低到高的顺序安排试验,试验期间需观察前一个剂量组不产生明显的药物不良反应,才进行下一个剂量组试验。经过临床观察以及尿液、血生化、心电图等指标的检查表明：BmrhGM-CSF胶囊单次用药在900μg以下为安全剂量范围,没有发生与药物相关的不良反应。为研究BmrhGM-CSF胶囊药效学,采取两种试验方案,一是选择14例实施化疗的肿瘤患者,分成2个剂量组：150μg和300μg,一天口服2次,连续14天,经过实验室检查发现BmrhGM-CSF胶囊在上述两个剂量下多次给药后没有发生与药物相关的不良反应,而且口服BmrhGM-CSF胶囊后可以预防因化疗导致的白细胞和中性粒细胞下降。另外一种方案是将48例肿瘤放、化疗病人随机分成2组：口服BmrhGM-CSF胶囊组(39人)以及安慰剂对照组(9人)；口服BmrhGM-CSF组于放化疗后第三天口服BmrhGM-CSF:一次300gg,一天2次,连续12天；安慰剂对照组于放化疗后第三天口服安慰剂：一次2粒,一天2次,连续12天。试验发现：在安慰剂组,给药后第3天白细胞和中性粒细胞均开始下降,到第9天白细胞数目下降到最低值为3.31×109/L、中性粒细胞数目为1.53×109/L；而在口服BmrhGM-CSF胶囊组,给药后第9天白细胞数目和中性粒细胞数目分别为4.61×109/L和2.32×109/L。上述结果表明口服BmrhGM-CSF胶囊能够改善肿瘤病人因放化疗引起的白细胞和中性粒细胞下降的症状。根据双处理、双周期、两序列的随机交叉试验设计方法,选择19例志愿者,口服BmrhGM-CSF 8μg/kg或皮下注射大肠杆菌表达的rhGM-CSF 3.75μg/kg,给药后按0h、0.5h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h.5.0h、6.0h、8.0h、10.0h、12.0h肱静脉取血,ELISA法测定血液中hGM-CSF浓度,结果表明19人口服BmrhGM-CSF后,有15人血液中检测到与正常血浆有显著差异的血药浓度,用梯形面积法计算药时曲线下面积AUC,根据试验品的AUC与参比品的AUC比值计算相对生物利用度得出BmrhGM-CSF经口服后在15人中有效吸收的平均生物利用度为1%,最高为3.1%。二、BmrhGM-CSF胶囊口服吸收机制的研究BmrhGM-CSF经125I标记后,按10μg/kg、50μg/kg的剂量给ICR小鼠灌胃,给药后在不同的时间收集尿液检测放射活性,结果表明,口服125I-BmrhGM-CSF8h后,经尿液排出大约18%的125I总放射活性。同时在口服125I-BmrhGM-CSF30min后采血,离心析出血清,SDS-PAGE电泳后放射自显影,在高剂量组(50μg/kg)出现一条有125I放射性的条带,大小约18-20 kDa,这条带为125I-BmrhGM-CSF的部分降解产物,低剂量组没有出现125I放射性的条带,说明125I-BmrhGM-CSF可以吸收入血。SD大鼠灌胃50μg/kg、10μg/kg的BmrhGM-CSF,给药后15min在大鼠血清中可检测到GM-CSF。两组大鼠在给药后30min时内血清中GM-CSF浓度达到最高值分别是1010ng/L、212ng/L,然后逐渐下降,一直维持到12h,12h后所有大鼠血浆中均无法测出GM-CSF。说明SD大鼠口服BmrhGM-CSF胶囊后可以被吸收入血。设计自身交叉试验,取3名志愿者口服BmrhGM-CSF或注射rhGM-CSF后0h,1h,2h,3h,4h后的血清样品进行质谱分析(Q-Trap MS/MS TOF),对各取样点进行EMS扫描,得出各点的一级谱图,以Oh为参照点,其它点分别与之比较,得出差异峰,对差异峰进行EPI扫描,进而得出此差异峰的分子量及其可能的氨基酸序列。以Oh的血清样本的MS数据为对照,在其余不同时间EM峰中找出差异峰,并对这些差异峰作进一步分析。根据分子量建立的肽图谱表明,在差异峰中存在hGM-CSF肽片段,这些大小不同的多肽分子量范围是2039到7336Da,证明通过口服,BmrhGM-CSF可以经肠道吸收进入血液。将蚕蛹冻干粉与大肠杆菌表达的rhGM-CSF混合给小鼠灌胃,结果证明小鼠灌胃这种混合物后其血液中rhGM-CSF浓度升高。将蚕蛹匀浆,离心除去沉淀,将上层溶液置于分液漏斗,分离富脂蛋白层和蛋白质层,制成冻干粉,分别作为载药材料包裹大肠杆菌表达的rhGM-CSF并且给小鼠灌胃。试验结果表明将蚕蛹富脂蛋白层作为载药材料包裹rhGM-CSF给小鼠灌胃后30mmin和60min的血药浓度显著上升,分别为98.73ng/L、106.28ng/L。将蚕蛹蛋白层作为载药材料包裹rhGM-CSF给小鼠灌胃后30min和60min的血药浓度也会上升,分别为48.73ng/L、76.25ng/L,说明蚕蛹富脂蛋白层和蛋白质层均可以促进rhGM-CSF的口服吸收,而且蚕蛹富脂蛋白层作为载药材料包裹rhGM-CSF的效果比蚕蛹蛋白层的要好。将大肠杆菌表达的rhGM-CSF用蚕蛹富脂蛋白层包裹后给小鼠灌胃后取血清,用快速液相色谱(FPLC)的10 RI反相柱进一步纯化血清样品的蛋白质,按峰自动收集,再利用MALDI-TOF MS进行质谱分析,结果发现口服rhGM-CSF的小鼠血清中存在14.5kDa的rhGM-CSF,其质谱图类似于皮下注射大肠杆菌表达的rhGM-CSF的小鼠血清质谱图。另外,用5%戊二醛固定蚕蛹富脂蛋白层承载的rhGM-CSF于铜台上,在扫描电子显微镜下观察到蚕蛹富脂蛋白层包裹的rhGM-CSF样品形成近似球形的微囊结构,这种脂质微囊具有脂溶性,它可能与小肠壁绒膜细胞膜融合,通过胞饮作用将rhGM-CSF微囊球通过生物膜内陷形成细胞吞噬体而进入细胞内,继而将rhGM-CSF从小肠壁外转运到小肠壁内。将蚕蛹蛋白通过Sephadex G-150分离柱的分离纯化,我们收集到36管蛋白样品。应用Biacore X-100分析发现其中有1管蛋白样品能够与大肠杆菌表达的rhGM-CSF结合,说明蚕蛹蛋白中存在与rhGM-CSF结合因子,这些因子可能有助于rhGM-CSF通过口服吸收入血,对于这些因子的结构和组成需进一步分析。本论文不仅为BmrhGM-CSF胶囊的Ⅱ期临床研究提供了前期的实验依据,而且也为开发其他家蚕生物反应器生产的同类多肽和蛋白质药物口服剂型提供了一定的理论基础。