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目的：微小RNA(microRNA,miRNA)是一类19-22个核苷酸的内源性非编码小RNA,miRNA的5-非翻译区的2-7个核苷酸的“种子序列”可以与靶mRNA的3-非翻译区互补结合,在转录后水平调控靶基因的表达。1993年,miRNA-lin-4被发现,此后又陆续从线虫、果蝇、家鼠、拟南芥及人类等多种真核生物中发现了这类小分子RNA,据推测在人类染色体上就有1000余种miRNA,目前已有超过700种得到确认。miRNA的编码基因是目前最大的一类调节基因。它在细胞的生长、增殖、发育和凋亡等诸多重要过程中均发挥了关键作用,并与多种肿瘤的发生发展密切相关。大量研究表明,miRNAs在肿瘤中扮演着相当于癌基因或抑癌基因的角色,调节肿瘤细胞的多种重要的生物学行为。
胃癌(gastric cancer)是世界上最常见的恶性肿瘤之一;在我国其发病率居各类肿瘤的首位,每年有超过17万人死于胃癌。目前,住院病例中90％为进展期胃癌,尽管针对胃癌的诊断和治疗已经有了长足的进步,但进展期胃癌的预后依然很差,五年生存率长期徘徊在30％左右。近年来已发现胃癌的发生是多基因改变的结果,且已有证据表明miR-21,miR-191,miR-223,1et-7a microRNA,miR-106b-25亚群等与胃癌的发生密切相关:1et-7microRNA,miR-155等与胃癌的侵袭与转移密切相关。随着越来越多的miRNA在胃癌中被发现,miRNA在胃癌的基因诊断和治疗中将发挥更为重要的作用。
目前,还没有关于miR-192及miR-215与胃癌关系的研究。我们参考大量国内外相关文献以及前期有关胃癌miRNA表达谱的研究,初步地确定miR-192及miR-215为研究重点。利用荧光实时定量PCR技术检测了119例胃癌组织相对于其配对癌旁非瘤组织中miR-192及miR-215的表达水平及其与胃癌临床病理学特点的关系。通过使胃癌细胞系过表达miR-192和miR-215,初步探索其在胃癌发生发展中发挥的作用。
方法：
一、miR-192及miR-215在胃癌组织中的表达收集119例胃癌患者的肿瘤及配对癌旁非瘤组织手术标本,提取总RNA,经过加尾,抽提纯化,反转录后,利用荧光定量real-time PCR分别检测miR-192及miR-215相对于癌旁非瘤组织的表达量。如果相对表达量小于1,认为是低表达;反之,如果相对表达量大于1,认为是高表达。然后,利用统计学方法分析miR-192及miR-215各自与临床病理资料间的关系,同时分析miR-192与miR-215在胃癌组织中表达的相关性。
二、miR-192在胃癌细胞系中的表达及对增殖和侵袭的影响在胃癌组织中随机选取十个癌旁非瘤组织作为胃癌细胞系的阴性对照。利用荧光定量real-time PCR检测miR-192在胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823中的表达水平。向胃癌细胞系SGC-7901中转染miR-192 mimics,使miR-192在胃癌细胞系SGC-7901中过表达,通过MTT实验检测其对胃癌细胞增殖的影响,通过transwell侵袭实验检测其对胃癌细胞侵袭的影响。
三、miR-215在胃癌细胞系中的表达及对增殖和侵袭的影响在胃癌组织中随机选取十个癌旁非瘤组织作为胃癌细胞系的阴性对照。利用荧光定量real-time PCR检测miR-215在胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823中的表达水平。向胃癌细胞系SGC-7901中转染miR-215 mimics,使miR-215在胃癌细胞系SGC-7901中过表达,通过MTT实验检测其对胃癌细胞增殖的影响,通过transwell侵袭实验检测其对胃癌细胞侵袭的影响。
结果：
一、miR-192及miR-215在胃癌组织中的表达
1、在人胃癌组织中未发现miR-192较其相应周围非瘤组织显著低表达。在119例胃癌组织中,其中63例(53％)miR-192低表达(p=0.076)。miR-192的低表达与肿瘤的大小(p=0.001)、大体分型(p=0.005)和pT分期(p=0.023)相关。肿瘤越大,分期分型越重,miR-192的表达量越低。
2、在人胃癌组织中未发现miR-215较其相应周围非瘤组织显著低表达。在119例胃癌组织中,其中60例(50％)miR-215低表达(p=0.332)。miR-215的低表达与肿瘤的大小(p=0.001)相关。肿瘤越大,miR-215的表达量越低。
3、miR-192及miR-215两种miRNA分子在胃癌组织中的表达存在显著的相关性。(Pearson r=0.906,p＜0.001)4、PCR产物经TA克隆,DNA测序后与miRBase上公布的miR-192和miR-215序列比对正确、完整。
二、miR-192在胃癌细胞系中的表达及对增殖和侵袭的影响荧光定量real-time PCR结果显示,miR-192在人胃癌细胞系SGC-7901(p＜0.001)、MGC-803(p＜0.001)和BGC-823(p＜0.001)中与随机选取的10例周围非瘤组织相比显著低表达。MTT法绘制的生长曲线表明,对于人胃癌细胞系SGC-7901,自24小时开始,转染了miR-192 mimics实验组细胞的增殖速率未显著低于阴性对照组(p＞0.05)及空白对照组(p＞0.05)。应用transwell肿瘤侵袭实验直接计数各组的穿膜细胞数,发现对于人胃癌细胞系SGC-7901,第20小时时,转染了miR-192 mimics实验组细胞穿过膜的数量未显著低于阴性对照(p＞0.05)及空白对照组(p＞0.05)。
三、miR-215在胃癌细胞系中的表达及对增殖和侵袭的影响荧光定量real-time PCR结果显示,miR-215在人胃癌细胞系SGC-7901(p＜0.001)、MGC.803(p＜0.001)和BGC-823(p＜0.001)中与随机选取的10例周围非瘤组织相比显著低表达。MTT法绘制的生长曲线表明,对于人胃癌细胞系SGC-7901,自24小时开始,转染了miR-215 mimics实验组细胞的增殖速率未显著低于阴性对照组(p＞0.05)及空白对照组(p＞0.05)。应用transwell肿瘤侵袭实验直接计数各组的穿膜细胞数量,发现对于人胃癌细胞系SGC-7901第20小时时,转染了miR-215 mimics实验组穿过膜的细胞数量未显著低于阴性对照(p＞0.05)及空白对照组(p＞0.05)。
结论：
一、胃癌组织中miR-192的表达量未显著低于其周围非瘤组织。miR-192的低表达与肿瘤大小、大体分型及pT分期相关。
二、胃癌组织中miR-215的表达量未显著低于其周围非瘤组织。miR-215的低表达与肿瘤大小相关。
三、miR-192及miR-215两种miRNA分子在胃癌组织中的表达存在显著的相关性。
四、胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803和BGC-823中,miR-192的表达量显著低于非瘤对照组。
五、胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803和BGC-823中,miR-215的表达量显著低于非瘤对照组。
六、miR-192的过表达未显著抑制胃癌细胞系细胞的增殖和侵袭。
七、miR-215的过表达未显著抑制胃癌细胞系细胞的增殖和侵袭。