系统性红斑狼疮(SLE)是一种以T细胞自身免疫反应性和B细胞产生大量自身抗体为特征,累及多系统、多器官,严重危害人类健康的慢性自身免疫性疾病。近年来,越来越多的研究表明表观遗传机制异常在SLE的发生、发展中起着重要的作用,但其确切的机制尚不十分清楚。DNA甲基化是重要的表观遗传调控机制之一,在胚胎发育、遗传印记、X染色体失活、染色质重塑等方面起重要作用。DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶介导,以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体,在DNA脱氧胞嘧啶(deocytosine)的第5位碳原子上加入一甲基基团。这一过程多发生在CpG二核苷酸,是哺乳动物基因组DNA最常见的化学修饰。基因启动子区CpG岛的甲基化可以使一些转录因子无法与靶基因结合而抑制基因的转录,而该区域的去甲基化则可以激活基因的转录。DNA甲基化抑制剂体外可诱导T细胞DNA低甲基化,将其注射入小鼠体内可以诱发狼疮样自身免疫反应。SLE患者T细胞基因组DNA低甲基化,且DNA低甲基化程度与DNA甲基转移酶1(DNMT1)的活性及水平密切相关。除基因组DNA低甲基化外,SLE患者T细胞与自身免疫相关基因调控序列也呈现低甲基化,这些基因包括CD11a(ITGAL)、CD70(TNFSF7)、CD40L(TNFSF5)和Perforin(PRF1)。过度表达这些基因的T细胞具有自身反应性,杀伤自身巨噬细胞或辅助B细胞产生大量的自身抗体。研究结果表明T细胞DNA低甲基化在SLE的发生、发展中起十分重要作用。但是,SLE患者DNA低甲基化的分子机制,目前仍不清楚。MicroRNAs (miRNAs)是一类源于内源性染色体上的非编码单链RNA,长度为21-25nt的短序列,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。虽然从发现miRNAs到现在只有十余年,miRNAs却成为近年生命科学研究领域的一个焦点。最近的研究显示miRNAs参与表观遗传调控及各种免疫反应,可以作为自身免疫疾病诊断的生物学标记或者治疗靶点。因此,本课题研究组前期利用miRNA microarray技术比较10例SLE患者和10例健康对照者CD4+T细胞miRNA表达谱的差异,发现11种miRNAs在SLE表达异常,其中miR-126等六种miRNAs在SLE表达异常升高,而miR-143-3p/5p等五种miRNAs在SLE表达异常降低。进一步用stem-loop RT-PCR证实miR-126在SLE CD4+ T细胞表达显著升高,而miR-142-3p明显降低,miR-638和miR-142-5p在SLE和正常对照组CD4+T细胞表达无明显差异。我们在Mirbase/Targetscans/PicTar等多个国际权威数据库查找异常表达miRNA潜在靶基因,发现DNMT1是miR-126的潜在靶基因。更有趣的是,我们发现SLE CD4+ T细胞miR-126的表达与DNMT1的蛋白表达水平成负相关。因此,我们提出：miR-126过度表达→靶向抑制DNMT1表达→T细胞基因调控序列低甲基化→T细胞自身免疫反应相关基因过度表达→杀伤自身巨噬细胞或辅助B细胞产生大量自身抗体→SLE。这一假定的发病机制首先通过体外萤光素报告载体验证DNMT1是否为miR-126的靶基因；CD4+T细胞中过表达miR-126对DNMT1的表达,自身免疫相关基因的表达及其调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响；抑制miR-126过表达对SLE CD4+ T细胞DNMT1的表达,自身免疫相关基因的表达及其调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。通过这些研究揭示了miR-126异常高表达是导致SLECD4+T细胞DNA低甲基化及自身免疫反应的重要分子机制,为寻找治疗SLE有效的新靶标提供了理论依据。目的：预测及验证miR-126的靶基因。方法：运用Mirbase/Targetscans/PicTar等靶基因预测软件查找miR-126可能的靶基因,筛选出与SLE发病过程密切相关的基因作为候选靶基因,我们选定DNMT1为靶基因,然后构建萤火虫荧光素酶表达载体,在Jurkat细胞中验证miR-126与DNMT1之间的关系。将包含DNMT1的3’-UTR区克隆至pMIR-REPORTER Luciferase vector (Ambion)载体编码荧光素酶基因序列,构建DNMT1野生型(Dnmt1WT-luciferase)荧光素酶报告基因,同时采用点突变的方法使DNMT1-3’-UTR中miR-126的结合位点发生碱基突变,构建突变型(Dnmt1Mut-luciferase)荧光素酶报告基因,与miR-126表达质粒(psilencer4.1-CMV-miR-126)和阴性对照质粒(pSilencer4.1 CMV-negative)用电穿孔法瞬时共转染至Jurkat细胞,转染48小时后收集细胞,运用双荧光素酶报告基因检测系统,以海肾荧光素酶作为内参照,检测萤火虫荧光素酶的活性。结果：通过生物信息学预测软件我们发现多种miR-126的可能靶基因,我们选定在SLE发病过程中发挥重要作用的DNMT1基因作为靶基因；在Jurkat细胞中共转染psilencer4.1-CMV-miR-126,可以抑制DNMT1野生型(Dnmt1WT-luciferase)荧光素酶活性,而当DNMT1-3’-UTR突变修饰后(Dnmt1Mut-luciferase), miR-126不能抑制其表达。结论：DNMT1为miR-126的靶基因,miR-126通过作用于DNMT1-3’-UTR区抑制基因的表达。目的：诱导miR-126过表达对正常人CD4+T细胞DNMT1的表达、甲基化敏感基因的表达、调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。方法：构建miR-126表达质粒(psilencer4.1-CMV-miR-126)和阴性对照质粒(pSilencer4.1 CMV-negative),电穿孔法瞬时转染正常人CD4+T细胞,采用Real-time RT-PCR法检测甲基化敏感基因CD11a、CD70及DNMT1 mRNA的表达,流式细胞仪检测CD11a和CD70蛋白表达,亚硫酸氢钠基因组测序法检测CD11a (ITGAL)、CD70 (TNFSF7)调控序列甲基化状态的改变,采用Western blotting法检测DNMT1蛋白水平,ELISA方法检测自身B细胞IgG抗体产量。结果：转染psilencer4.1-CMV-miR-126的CD4+T细胞CD11a和CD70 mRNA水平升高,CD70、CD11a蛋白水平增高,DNMT1蛋白水平降低,自身B细胞的IgG抗体产量增加,差异均有显著统计学意义(P<0.05或P<0.01)。但DNMT1 mRNA水平无显著差异(P=0.377)。亚硫酸氢钠测序结果显示CD11a (ITGAL)、CD70 (TNFSF7)启动子调控序列平均甲基化水平均显著降低(P<0.05,P<0.05)。结论：miR-126过表达可降低正常CD4+T细胞自身免疫相关基因甲基化水平,诱导自身免疫反应。目的：抑制miR-126表达对SLE CD4+T细胞自身免疫反应相关基因的表达及其调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。方法：设计针对miR-126的inhibitor及对照组(杂乱无序的寡核苷酸),电穿孔法瞬时转染活动性SLE患者的CD4+T细胞,采用Real-time RT-PCR法检测DNMT1 mRNA,自身免疫反应相关基因CD11a、CD70 mRNA的表达,流式细胞仪检测CD11a、CD70蛋白水平,同时亚硫酸氢钠基因组测序法检测CD11a (ITGAL)、CD70 (TNFSF7)序列特异性甲基化状态的改变,采用Western blotting法检测DNMT1蛋白水平,ELISA法检测自身B细胞IgG抗体产量。结果：转染miR-126 inhibitor后CD4+T细胞CD11a和CD70mRNA水平均明显降低(P<0.05)。CD11a和CD70蛋白表达也明显降低(P<0.05),DNMT1蛋白水平显著增高(P<0.05), DNMT1 mRNA表达水平无显著差异(P=0.938),自身B细胞的IgG抗体产量下降(P<0.01)。亚硫酸氢钠测序结果显示CD11a (ITGAL), CD70 (TNFSF7)启动子调控序列平均甲基化水平显著增高(P<0.05,P<0.05)。结论：抑制miR-126的表达可上调SLE患者CD4+T细胞自身免疫密切相关基因的甲基化水平,抑制自身免疫反应。目的：探讨SLE患者CD4+T细胞miR-126宿主基因EGFL7的甲基化水平对miR-126表达的调控。方法：采用Real-time RT-PCR方法检测SLE患者CD4+T细胞EGFL7基因mRNA表达水平；亚硫酸氢钠基因组测序法检测EGFL7基因启动子区甲基化状态。结果：miR-126宿主基因EGFL7在SLE患者CD4+T细胞表达上调(P<0.01), EGFL7 mRNA表达水平与miR-126 mRNA的表达成正相关(R=0.538,P=0.015)。miR-126是一个内含子miRNA,位于宿主基因EGFL7基因座第7个内含子中,其自身的基因序列中包含29个CpG位点。但该区域甲基化水平在SLE患者CD4+T细胞和正常对照组间无显著差异(P=0.907)。而SLE患者CD4+T细胞中EGFL7基因启动子区甲基化水平显著降低(P<0.05)。结论：SLE患者CD4+T细胞miR-126宿主基因EGFL7启动子区甲基化状态调控宿主基因本身及其miR-126的表达。