背景:在当今世界,缺血性心脏病(Ischemic heart disease,IHD)是引发死亡的重要原因。目前经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention,PCI)等心血管介入技术的广泛临床应用,旨在恢复心肌灌注,心肌缺血组织的灌注恢复能使缺血得到快速纠正,患者的主观感受能得到明显好转,但恢复灌注也可出现缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion,I/R),甚至血管再狭窄。因此,如何有效降低缺血再灌注损伤和防止血管再狭窄,在IHD的治疗中显得十分重要,然而,时至今日依然缺乏业界公认的特别有效的治疗方法。VEGF-B长久以来被视为是血管内皮生长因子家族中一个模糊不清的成员,VEGF-B可与VEGFR-1和NRP-1辅助受体结合。目前,国内外关于VEGF-B对心脏的作用研究,主要集中在利用转基因方法的研究。转基因相关研究报道,VEGF-B可以调节心脏中的血管和心肌细胞的生长、组织代谢和细胞存活。转基因方法由于载体的安全性和可控性原因,在实际应用中存在较大争议。本课题组前期的研究显示,心脏干细胞(cardiac stem cells,CSC)具有VEGFR1表达的特征,部分参与了 VEGF-A诱导的CSC迁移,并能通过诱导血管生成来修复梗塞的心脏。然而,VEGF-B能否通过表达有VEGFR1的CSC诱导I/R损伤心脏的血管生成来修复梗塞的心脏尚不清楚。目前,VEGF-B在心肌I/R、心肌梗死、心力衰竭的发展过程中对短期和长期预后所发挥的作用亦不清楚。鉴于临床应用时,人类VEGF-B蛋白注射相比转基因方法更容易被患者接受,因此,本研究旨在探讨重组人VEGF-B蛋白对I/R损伤心脏的保护作用及机制,揭示VEGF-B在心肌缺血心力衰竭的发展中对短期和长期预后所起作用,为VEGF-B蛋白进一步的临床应用提供实验依据,具有重大的现实意义。目的:探讨重组人VEGF-B蛋白对在体I/R损伤大鼠心脏及H/R损伤的离体H9c2心肌细胞的短期保护作用及潜在机制;研究VEGF-B诱导的血管生成和CSCs之间所存在的关系,揭示VEGF-B对I/R损伤心脏的长效保护作用及潜在机制。方法:(1)冠状动脉前降支结扎1h后松结扎法,复灌1天以建立在体心脏I/R短期模型。成年雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、I/R损伤组、VEGF-B低剂量治疗组(1.0μg/kg)及VEGF-B高剂量治疗组(10.0μg/kg)。松结扎后立即行VEGF-B处理,复灌24h后,先利用BL420S生物信号记录系统记录和测量心脏血流动力学参数,分析VEGF-B对I/R损伤心脏的功能影响;随后取心肌组织行1%TTC染色以评价心肌梗死面积变化;再利用比色法、酶联免疫法检测VEGF-B对反应心肌损伤的CK、cTnT含量及CK-MB活性的影响;接着,利用TUNEL法评价VEGF-B对I/R损伤后心肌组织凋亡的影响;最后利用Western blot分析VEGF-B对I/R损伤后心肌凋亡和自噬保护有关的信号分子影响。(2)体外利用H9c2心肌细胞缺氧-复氧(H/R)模型,给予VEGF-B处理后。首先分别利用比色法检测LDH水平评价细胞损伤程度;其次,利用DAPI染色法、Annexin V/PI流式细胞术和Western blot评价VEGF-B对H/R诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响及其相关信号通路的变化。然后,利用Ad-mRFP-GFP-LC3系统评价VEGF-B对H/R所介导的H9c2心肌细胞自噬小体和自噬流的影响,再利用Western blot检测LC3以确认其自噬特征。接着,在体外诱导或阻断自噬后,观察VEGF-B对H/R所诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响。最后,检测阻断相关信号通路后,观察VEGF-B对H/R所诱导的H9c2心肌细胞自噬的影响。(3)在体利用大鼠心脏I/R模型,复灌7天后以建立在体心脏I/R长期模型。首先使用BL420S生物信号记录系统检测各组心脏血流动力学指标,分析VEGF-B对在体I/R损伤后心脏功能的影响。其次,利用免疫荧光技术检测α-SMA阳性血管平滑肌细胞以计数大血管,检测vWF Ⅷ阳性内皮细胞以计数小血管,以评价VEGF-B对心脏I/R后血管生成和血管新生的影响。然后,再利用免疫荧光技术分别检测c-kit阳性细胞以计数评价CSC数目,Western blot检测心肌组织SDF-1α和HGF的表达变化,以评价CSC数目与其之间的关系。最后,体外利用VEGF-B处理的H9c2条件培养基观察其对CSC来源的内皮肌管形成的影响,并利用SDF-1α受体和HGF受体抑制剂去确认VEGF-B对CSC分化形成的肌管与SDF-1α和HGF的关联。结果:(1)心脏I/R损伤1天后,与I/R组相比,VEGF-B组心肌梗死面积明显减小,心脏左心室功能明显改善,且高剂量VEGF-B组(10 μg/kg)较低剂量VEGF-B组(1μg/kg)作用效果更为明显。VEGF-B抑制I/R损伤心脏的CK、CK-MB活性、降低cTnT水平,有效降低了大鼠心肌I/R损伤的程度。TUNEL法显示,VEGF-B显著降低了 I/R心肌细胞的凋亡率。Western blot显示,与I/R组相比,VEGF-B处理后心肌细胞Bcl-2表达明显增多,而Bax表达显著减少;且VEGF-B以剂量依赖的方式降低了 LC3-Ⅱ/Ⅰ比值,更趋近于假手术组,暗示其抑制了细胞自噬;与此同时,发现VEGF-B以剂量依赖的方式增加了 pAkt水平,而降低了 pp38MAPK 水平。(2)在体外H9c2心肌细胞缺氧复氧(H/R)模型,VEGF-B以剂量依赖的方式降低了 H9c2细胞释放的LDH水平,增加了 Bcl-2水平、降低了 Bax水平,抑制了 H9c2心肌细胞凋亡与自噬;且以相似的方式显著增加了 pAkt、轻度增加pERK1/2而明显降低pp38MAPK水平。VEGF-B所介导的Bcl-2/Bax表达变化及抗凋亡效应能被PI3K/Akt阻断剂LY294002和p38MAPK阻断剂SB203580所取消。与此同时,VEGF-B也降低了自噬有关的LC3和Beclin1的水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比率,这一特殊效应也能被LY294002和SB203580所取消。在H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤模型,自噬诱导剂雷帕霉素逆转了 VEGF-B介导的抗细胞凋亡作用,同时也逆转VEGF-B介导的抗自噬作用和LC3-Ⅱ/Ⅰ比率及Beclin1表达变化,相反的,自噬抑制剂氯喹增强了 VEGF-B介导的抗自噬和抗凋亡作用。(3)心脏I/R损伤7天后,与I/R组相比,VEGF-B呈剂量依赖地增加了LVSP、±dp±dtmax,降低了 LVEDP,心脏左心室的功能得到了显著改善。VEGF-B呈剂量依赖地增加了 SDF-1α和HGF的表达,同时心肌组织中c-kit阳性的CSC数量也呈剂量依赖地增加,而且vWFⅧ阳性的小血管和α-SMA阳性的大血管密度也呈现类似的增加;VEGF-B处理的H9c2条件培养基显著促进CSC分化并形成肌管,且该作用可被SDF-1α受体CXCR4抑制剂AMD3100或HGF受体c-Met的抑制剂SU11274部分取消,暗示VEGF-B通过SDF-1α和HGF激活CSC诱导血管新生而改善心脏功能。结论:在心肌I/R损伤24小时后,重组人VEGF-B蛋白通过调控PI3K/Akt和p38MAPK信号通路抑制I/R诱导的心肌细胞自噬,进而抑制I/R诱导的心肌细胞凋亡。在I/R心肌梗死一周后,重组人VEGF-B蛋白通过诱导SDF-1和HGF的表达而激活CSCs动员,并由CSCs介导血管生成和血管新生。因此,VEGF-B通过短期的心肌细胞保护和长期的CSCs激活的双重效应改善I/R心脏的结构和功能。