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光皮桦为我国特有的优良用材树种,系桦木科（Betulaceae）桦木属（Betula）落叶乔木。光皮桦具有较高的经济价值和广泛的用途,其材质优良,木材坚硬,已被国家列入一类材。光皮桦作为一种优良的速生阔叶树种,对于发展山区经济,调整林分结构,改善生态环境都有十分重要的意义。本文从光皮桦EST(ExpressedSequenceTags,EST)序列开发出微卫星标记,并应用于光皮桦遗传多样性分析和遗传图谱的构建。
光皮桦转录组随机测序获得53799条序列,通过序列前处理和聚类拼接后得到37662条,共计1687.3kb的无冗余Unigene。对处理后的ESTs进行微卫星搜索,共搜索到4419个SSRs,分布于3692条ESTs中,平均每3.8kb出现一个SSR位点,SSR出现的频率是11.73％。五种重复类型中主要是三核苷酸重复,占所有SSRs的50.03％;但含量最丰富的SSR重复类型是AG/TC二核苷酸重复类型,占总SSR位点数的11.00％,而三核苷酸重复中出现频率较高的是CTT/GAA,只占总SSR位点数的5.45％。本文还依据搜索出的SSRs设计了引物,共获得引物3085对。
采用正交设计L25(56)优化EST-SSRPCR反应体系,确定最佳PCR反应体系为DNA模板浓度4ng·μL-1,引物浓度0.500μmol·L-1,Mg2+1.25mmol·L-1,dNTPs0.250mmol·L-1,Taq酶0.0725U·μL-1。通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。对优化出的EST-SSRPCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得稳定、清晰可辨的DNA谱带。
选择其中SSR大于16bp的引物308对在公司合成,先用8个无性系个体进行多态性初筛,260对引物有扩增产物,其中131对具有多态性。再选择其中60对高多态性的EST-SSR引物对光皮桦育种群体77个无性系进行遗传多样性分析,结果显示此育种群体内的遗传差异与天然群体相近,同时UPGMA法聚类显示不同的光皮桦无性系组间差别明显。
以包含78个个体的F1代群体为作图群体,应用SSR分子标记,构建了光皮桦母本和父本遗传图谱。母本遗传图谱包含77个EST-SSR标记,共14个连锁群,覆盖基因组长度941.65cM,相邻两个标记间的平均距离为12.23cM,最大距离为99.7cM;父本遗传图谱包含107个EST-SSR标记,共17个连锁群,覆盖基因组长度1282.4cM,相邻两个标记间的平均距离为11.99cM,最大距离为72.3cM。