论文部分内容阅读
颅骨锁骨发育不全(cleidocranial dysplasia,CCD)是一种由runt相关的转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)突变引起的以骨骼发育不良为特征的先天性疾病,呈常染色体显性遗传。其典型的临床表现有前囟门闭合不全、锁骨发育不良、恒牙萌出障碍、多生牙等,并且,有研究显示CCD患者发生骨质疏松症的风险显著增加。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是具有多向分化潜能的干细胞,对维持骨骼系统的代谢平衡至关重要。研究显示,RUNX2单倍剂量不足会导致CCD患者的骨髓基质细胞(BMSCs-CCD)的生物学性能发生改变,但其内在机制仍有待探究。有研究通过大鼠骨髓基质细胞证实RUNX2从转录水平抑制micro RNA-31(mi R-31)的表达,但尚未在人类的骨髓基质细胞中得到验证。本研究拟分析CCD患者骨髓基质细胞生物学特性的改变,在此基础上探讨mi R-31对CCD患者骨髓基质细胞成骨功能的影响及其可能机制。第一部分:颅骨锁骨发育不全患者骨髓基质细胞的体外分离培养及生物学特性目的:体外分离培养CCD患者(BMSCs-CCD)和正常同龄对照组的骨髓基质细胞(BMSCs),并对其生物学特性进行分析比较。方法:(1)利用颌骨松质骨组织块贴壁法体外分离培养CCD患者和正常同龄人的BMSCs,待细胞从组织块中爬出形成集落且各集落开始融合时进行传代培养;CCK-8法、流式细胞周期以及Brd U细胞增殖实验分析比较两种细胞增殖能力。(2)实时定量PCR分析测定两种BMSCs中RUNX2的表达;成骨诱导后分别通过碱性磷酸酶、茜素红染色及Western blot方法分析两种细胞成骨分化能力的差异。(3)采用结晶紫染色检测克隆形成能力;检测多潜能转录因子比较两种细胞的干性水平;检测衰老调控关键因子的表达并通过β-gal衰老染色实验分析衰老表型差异;通过细胞免疫荧光验证BMI1在两种BMSCs中的表达差异。结果:(1)与正常对照BMSCs相比,BMSCs-CCD增殖缓慢,细胞在S期、G2期的百分率与Brd U阳性细胞率均较低。(2)分别对比3例CCD患者与正常同龄人BMSCs中RUNX2的表达差异,结果显示BMSCs-CCD中RUNX2的m RNA水平与蛋白水平均明显降低。对两种细胞进行成骨诱导,BMSCs-CCD中RUNX2、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)等成骨相关蛋白表达下降,碱性磷酸酶活性降低,且形成的矿化结节较少。(3)BMSCs-CCD组所形成的克隆集落少于BMSCs组,BMSCs-CCD组中多潜能转录因子OCT4、NANOG和SOX2的表达均低于BMSCs组。同时BMSCs-CCD组衰老细胞比率高于BMSCs组,且高表达衰老相关标记分子p16、p21,低表达衰老调控因子BMI1。BMSCs-CCD中BMI1阳性率显著低于BMSCs。结论:与正常对照BMSCs相比,BMSCs-CCD的增殖、成骨分化能力、克隆形成能力以及干性较弱,且细胞易于衰老。BMSCs-CCD生物学特性的改变可能会导致其成骨能力降低,继而影响CCD患者骨骼系统的平衡与稳定,并与CCD患者骨质疏松症的发生相关。调节细胞自我更新与衰老的关键因子BMI1的表达下降可能与BMSCs-CCD的衰老特性改变有关。第二部分:micro RNA-31调控CCD患者BMSCs成骨分化及衰老特性的机制研究目的:分析micro RNA-31(mi R-31)对CCD患者BMSCs成骨分化能力及衰老特性的影响,探讨RUNX2单倍剂量不足影响mi R-31表达的机制。方法:(1)实时定量PCR检测mi R-31在BMSCs-CCD和BMSCs中的表达差异。(2)在BMSCs中应用小干扰RNA敲减RUNX2(si-RUNX2),检测mi R-31表达变化;通过生物信息学网站分析预测RUNX2与mi R-31启动子区的可能结合位点,构建双荧光素酶报告基因质粒,在293T细胞中同时转染si-RUNX2与突变体或野生型质粒,检测分析荧光素酶活性差异。(3)在BMSCs-CCD中转染mi R-31干扰的慢病毒载体,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Western blot分析比较转染前后成骨分化能力的改变。(4)β-gal衰老染色实验检测转染前后细胞的衰老情况,并通过Western blot分析比较衰老调控关键因子的表达变化。结果:(1)相比于正常对照BMSCs,mi R-31在BMSCs-CCD中高表达。(2)敲减RUNX2后BMSCs中mi R-31的表达升高。应用si-RUNX2转染293T细胞可增强野生型mi R-31表达质粒的荧光素酶活性(p<0.05),而突变型组无统计学差异(p>0.05)。(3)慢病毒敲减mi R-31后,BMSCs-CCD的成骨分化能力显著增强,且SATB2与其它成骨相关因子表达上调。(4)BMSCs-CCD中衰老染色阳性率在转染mi R-31干扰慢病毒后显著降低,衰老相关标记分子p16、p21的表达下调,BMI1表达上升。结论:RUNX2能够在转录水平抑制mi R-31的表达。CCD患者RUNX2单倍剂量不足导致其骨髓基质细胞中mi R-31表达升高,高表达的mi R-31可能通过干预SATB2从而抑制BMSCs-CCD的成骨分化能力,并可能通过调节BMI1介导衰老表型的改变。第三部分:干预mi R-31对BMSCs-CCD成骨能力影响的动物实验研究目的:探究慢病毒敲减mi R-31后的BMSCs-CCD在体内环境下成骨能力的改变情况。方法:(1)使用Lev-GFP或Lev-mi R-31转染BMSCs-CCD,将转染后的BMSCs-CCD、空白对照BMSCs-CCD(Sham)以及BMSCs复合至HA/TCP生物支架材料中并植入BALB/C裸鼠皮下。(2)8周后取出标本,分别进行H&E染色、Masson三色染色以及免疫组织化学染色,观察其成骨情况。(3)检测成骨相关转录因子(osterix,OSX)和OCN的表达。结果:(1)吸附细胞的支架材料植入裸鼠皮下8周后,Lev-mi R-31组和BMSCs组的矿化组织显著多于Lev-GFP组、Sham组。(2)成骨早期指标OSX在Lev-mi R-31组和BMSCs组的表达高于Lev-GFP组和Sham组,且成骨晚期指标OCN在Lev-mi R-31组的表达高于Lev-GFP组、Sham组以及BMSCs组。结论:使用慢病毒敲减mi R-31后的BMSCs-CCD在裸鼠体内环境中成骨能力显著提升,提示抑制BMSCs-CCD中mi R-31的表达可有效改善其成骨能力。