多裂肌位于脊柱最内侧,是附着面积最大的椎旁肌,由多束组成,从颈部到骶部均有分布。其中腰多裂肌以腰椎的棘突为中心向两侧斜下方辐射,其作用主要是向斜下方牵拉棘突,从而保证腰椎的稳定性。腰多裂肌的损伤、萎缩以及功能紊乱与各种急慢性腰痛的发生密切相关。因此,促进损伤多裂肌的修复和功能重建有非常重要的临床意义。肌卫星细胞(Muscle Satellite Cell, MSCs)属于骨骼肌干细胞,肌肉损伤后,MSCs的激活、增殖和成肌分化与融合是肌肉修复过程中必不可少的环节。生理情况下,MSCs通常处于静止状态,一旦细胞的基膜遭到破坏,便开始激活、增殖、分化、融合成为新生的肌纤维。因此,MSCs的研究对于进一步理解肌肉的损伤修复和发病机制均有重要的价值。近年来,大量关于针刺治疗骨骼肌急慢性损伤的研究已经证实,针刺能促进MSCs增殖高峰期提前,促进肌肉修复,加速损伤愈合进程。“委中”穴属于足太阳膀胱经穴,对腰背部疾病有特异性的疗效,“腰背委中求”是委中穴对腰背部疾病特异性疗效的经验总结。我们前期实验已经证明电针“委中穴”能促进肌肉修复期MSCs的增殖、分化以及组织再生修复的成熟度,加快大鼠损伤多裂肌的再生修复。在前期研究中,我们发现电针“委中”穴在治疗第4天时,对生肌调节因子表达的影响最为显著,在治疗第7天时其表达即出现了下降,说明电针“委中”穴在肌肉恢复初期的作用更为活跃。因此,本研究拟从在体和离体两方面结合观察电针“委中”穴在肌肉恢复初期(4天时)对多裂肌组织的再生修复作用,以及对Pax7、Myod蛋白与PI3K/Akt/mTOR信号通路相关信号分子表达的影响,进一步探求电针“委中”穴对腰部多裂肌损伤后再生修复的作用机制。实验一：电针“委中”穴对腰多裂肌损伤模型大鼠Pax7、Myod表达的影响目的：在体观察电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤模型肌肉再生修复的影响。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、模型对照组、电针“委中”组、电针“肾俞”组,通过布比卡因局部肌肉注射的方法复制大鼠多裂肌损伤模型,电针“委中”组和电针“肾俞”组分别于模型建立后24h开始治疗,1次/日。于治疗第4天取材,HE染色观察各组大鼠腰多裂肌纤维损伤及修复情况,采用Western-blot方法观察各组肌肉组织中Pax7、Myod蛋白的表达。结果：(1)HE染色结果显示：正常组和模型对照组肌纤维细长均匀,排列整齐,纤维与纤维之间间隙匀称,细胞核均匀排列在肌细胞周围,模型对照组偶见细胞间质轻微水肿。模型组可见肌纤维广泛变性样坏死,巨噬细胞浸润明显,偶见未受损纤维束。电针“委中”组和电针“肾俞”组已经出现肌纤维的再生,纤维直径较大,已有部分细胞核向细胞周围迁移。(2) Western-blot结果显示,模型组Myod蛋白表达与正常组和模型对照组之间无显著性差异(P>0.05),电针“委中”组和电针“肾俞”组Myod蛋白表达优于其余三组(P<0.05),而电针“委中”组略优于电针“肾俞”组(P<0.05)。各组之间Pax7蛋白表达均无显著性差异(P>0.05)。结论：(1)电针“委中”穴和电针“肾俞”穴均能明显提高损伤局部Myod的表达,促进MSCs的成肌与分化；而对Pax7的表达无明显促进作用,可能与电针在促进成肌分化初期,细胞持续高表达Myod,却下调了Pax7蛋白的表达有关。(2)电针“委中”穴在损伤早期促进肌肉修复的作用略优于电针“肾俞”穴。实验二：单根肌纤维法分离培养大鼠多裂肌MSCs及鉴定目的：应用单根肌纤维法分离培养大鼠多裂肌MSCs并进行鉴定。方法：取大鼠1只,麻醉致死后,分离多裂肌,应用单根肌纤维法分离出单个MSC,并进行诱导分化,分别通过MSCs增殖与分化期不同的肌肉相关特异性标志蛋白进行鉴定。结果：(1)形态学观察：原代细胞经消化后,显微镜下观察,细胞呈圆形,高折光性。重新接种后12h,细胞大部分已经贴壁,伸展为长梭形或纺锤形,接种后3天,细胞明显增殖,接种后5天,MSCs开始出现方向性排列,接种后8天,MSCs方向性更加明显,并且有多核肌管形成。(2)免疫荧光鉴定：Pax7、Myod在MSCs增殖过程中核表达均为阳性。以含10μMIGF-1和2%马血清的分化培养基成肌诱导后,可出现肌管,Desmin在分化初期细胞质中表达为阳性。细胞贴壁7天后,不经诱导也可有肌管形成。结论：应用单根肌纤维法可以成功分离大鼠腰多裂肌MSCs, MSCs相关特异性标志物表达为阳性,经过成肌诱导,分离出的MSCs有分化为肌管的能力。实验三：电针血清对MSCs增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响目的：体外观察电针血清对MSCs增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。方法：实验一中正常组、模型组、电针“委中”组、电针“肾俞”组在取材后分别获取各组血清,将不同处理组的血清分别加到实验二分离并鉴定过的多裂肌MSCs中共同培养,电针“委中”血清组和电针“肾俞”血清组分别于加血清前2h加入P13K抑制剂LY294002,干预24h后,分别采取CCK-8、Edu检测电针血清对MSCs增殖能力的影响,同时采取Western-blot和RT-PCR的方法检测Pax7、Myod以及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关信号分子蛋白和mRNA的表达。结果：(1)CCK-8结果显示,与空白组相比,正常血清组、模型血清组、电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组OD值明显增加(P<0.01),模型血清组OD值优于正常血清组(P<0.01),电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组OD值优于模型组(P<0.01),加用LY294002后,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组OD值明显下降(P<0.01),电针“委中”血清组OD值与电针“肾俞”血清组之间无显著性差异(P>0.05)。(2)Edu结果显示,模型血清组、电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组中Edu阳性细胞比例明显优于正常血清组(P<0.05,P<0.01,P<0.01),电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组优于模型血清组(P<0.01,P<0.05),加用LY294002后,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组Edu阳性细胞比例明显下降(P<0.01,P<0.05),电针“委中”血清组与电针“肾俞”血清组之间无显著性差异(P>0.05)。(3) Western-blot结果显示,各组之间Pax7蛋白表达无显著差异；Myod蛋白表达模型血清组高于正常血清组(P<0.05),电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组优于模型血清组(P<0.05,P<0.01),电针“委中”与电针“肾俞”血清组之间无显著性差异(P>0.05),LY294002明显下调电针“委中”与电针“肾俞”血清组Myod的表达(P<0.05,P<0.01)；p-Akt表达模型血清组优于正常血清组(P<0.05),电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组优于模型血清组(P<0.01,P<0.05),电针“委中”与电针“肾俞”血清组之间无显著性差异(P>0.05), LY294002明显下调电针“委中”与电针“肾俞”血清组p-Akt的表达(P<0.01, P<0.01)。p-mTO R表达模型血清组高于正常血清组,电针“委中”血清组、电针“肾俞”血清组与模型血清组之间无显著性差异(P>0.05)。(4)RT-PCR结果显示,各组之间Pax7及Myod基因的mRNA表达均无显著差异,与Western-blot结果相反,模型血清、电针“委中”血清、电针“肾俞”血清Pax7、Myod的基因表达均有低于正常血清的趋势,与抑制剂组相比,电针“委中”血清、电针“肾俞”血清Pax7、Myod的基因表达也出现了降低的趋势。结论：(1)电针“委中”血清和电针“肾俞”血清均可促进MSCs的增殖,且有促进成肌分化的趋势,与PI3K/Akt通路有关,但电针血清对Pax7、Myod基因表达的规律仍需进一步的研究。(2)电针“委中”与电针“肾俞”穴的效应机制除血清途径外,可能还存在其他的作用途径。