因交通事故、运动损伤、老龄化、生殖缺陷或疾病等导致每年有大量人群的骨组织受损,甚至缺失。组织工程为有效修复受损骨组织提供了可能。种子细胞和支架是组织工程的两个核心组成部分。成骨细胞是骨组织工程典型的种子细胞,支架作为一种人工胞外基质,在为成骨细胞提供物理支撑的同时也为成骨细胞提供生长的微环境。支架材料的结构(包括化学结构、表面拓扑结构以及空间几何结构)调控成骨细胞的生命行为。同时,成骨细胞作为一种力敏感细胞,还需要接受合适的力学刺激才可能形成具有正常生理功能的骨组织。因此,支架和力学刺激共同构成了成骨细胞体外生化反应器的重要组成部分,二者共同调控成骨细胞行为,决定骨组织工程的成败。研究支架结构和力学因素共刺激对成骨细胞行为的影响对于设计和制造有利于形成功能性骨组织的支架材料和生化反应器有重要的指导意义。关于单独的支架结构或单独的力学刺激对成骨细胞行为的影响及其影响机制的研究报道已很多,但迄今却鲜见关于支架结构和力学刺激的共同作用对成骨细胞行为影响及其影响机制的报道。考虑到支架表面化学是最重要的支架结构信息之一,流体剪应力(FSS)是在体骨组织中最主要的力学刺激,本论文考查了支架表面化学和FSS共刺激对成骨细胞早期行为(FSS敏感因子ATP、NO、PGE2释放、早期增殖和早期分化)的影响及影响机制。黏着斑形成和细胞骨架形态都参与了材料表面化学和FSS影响成骨细胞行为的调控机制。因此,本论文还考查了表面化学-FSS共刺激之后黏着斑和细胞骨架形态变化及其与细胞早期行为之间的关系,并验证了有关共刺激机制的核心假设:黏着斑和细胞骨架是材料表面化学和流体剪应力共刺激调控成骨细胞行为的关键结构,材料表面化学通过调控成骨细胞黏着斑和细胞骨架结构来调控成骨细胞对流体剪应力的响应。主要的研究内容和所取得的结果如下:(1)利用硅烷化自组装技术在组织培养载玻片表面(Glass)构建OH、NH2和CH3表面,水接触角和X射线光电子能谱(XPS)分析表明已成功制得CH3、OH、NH2表面;构建了基于平行板流动腔的FSS加载装置;将成骨细胞接种在不同化学表面后置于平行板流动腔中,施加不同大小的FSS,从而成功构建了表面化学-FSS共刺激平台,为后续共刺激研究奠定了基础。(2)考查了单独表面化学刺激对成骨细胞黏着斑形成与F-actin骨架形态的影响,以及对细胞早期增殖潜能(PI)、碱性磷酸酶(ALP)活性和化学因子(ATP、NO、PGE2)释放的影响,相关结果为后续共刺激研究提供对照。结果表明,NH2刺激使成骨细胞F-actin纤维束粗壮、黏着斑数量多且尺寸大,而CH3和OH刺激使成骨细胞F-actin组织和黏着斑结构疏松,呈现化学依赖性NH2(>Glass)>OH≈CH3;与Glass表面相比,NH2表面明显促进而CH3和OH表面明显抑制成骨细胞早期增殖和分化;表面化学对ATP和NO的释放没有显著影响,但对PGE2释放有影响。(3)考查了表面化学与不同大小FSS共刺激对成骨细胞化学因子(ATP、NO和PGE2)释放、增殖潜能、ALP活性,和细胞粘附的影响。①低流体剪应力(5 dynes/cm2,低于骨组织生理FSS,记为LFSS)与材料表面化学共同刺激:与单纯的表面化学刺激相比,LFSS明显提高CH3和OH表面成骨细胞的化学因子释放和增殖潜力,而对Glass和NH2表面的成骨细胞没有显著影响;LFSS明显提高了CH3和OH表面成骨细胞的取向性或细胞铺展状态,而对NH2和Glass表面成骨细胞没有影响。结合LFSS刺激前(单独表面化学刺激)各化学表面上成骨细胞的F-actin骨架和黏着斑状态,提示其可能机制是表面化学刺激通过影响成骨细胞黏着斑形成和F-actin骨架形态,导致CH3和OH表面上成骨细胞对LFSS的敏感性高,而NH2表面上成骨细胞对LFSS的敏感性低。就FSS敏感性而言,在LFSS环境中,CH3和OH是合适的骨组织工程支架表面化学结构。②生理流体剪应力(12 dynes/cm2,最佳骨组织生理FSS,记为PFSS)与材料表面化学共同刺激:与单纯的表面化学刺激相比,PFSS明显提高所有化学表面成骨细胞的化学因子释放和早期增殖,且具有明显的表面化学依赖性NH2-PFSS(>Glass-PFSS)>OH-PFSS≈CH3-PFSS;PFSS使所有化学表面成骨细胞的取向或形态都发生了改变。结合PFSS刺激前(单独表面化学刺激)各化学表面上成骨细胞的F-actin骨架和黏着斑状态,提示细胞黏着斑和F-actin骨架在表面化学-PFSS共刺激调控成骨细胞行为中有重要作用。在PFSS环境中,NH2是最合适的骨组织工程支架表面结构。③高流体剪应力(20 dynes/cm2,高于最佳骨组织生理FSS,记为HFSS)与材料表面化学共同刺激:CH3和OH表面成骨细胞不能承受HFSS刺激,发生明显的脱落和细胞膜破裂现象,而NH2表面细胞能够承受HFSS的刺激,并沿HFSS发生明显的细胞取向。与单纯的表面化学刺激相比,HFSS明显促进NH2表面成骨细胞的化学因子释放,并显著提高细胞增殖潜能。上述结果提示,在HFSS环境中,CH3、OH或CH3/OH混合结构不适合用作骨组织工程支架的表面化学结构,而NH2是合适的表面化学结构。(4)系统分析了不同大小FSS(LFSS、PFSS、HFSS)与材料表面化学共刺激对成骨细胞早期行为的影响,并结合黏着斑抑制和F-actin细胞骨架阻断实验结果解析了表面化学-FSS共刺激对成骨细胞行为的调控机制。①通过引入FSS响应阀值(细胞能感受到的最低FSS)、破坏阀值(使细胞脱落或细胞膜破裂的最低FSS)和最佳阀值(使细胞具有最佳响应的FSS)这三个概念,系统分析了不同大小FSS(LFSS、PFSS、HFSS)与表面化学共刺激对成骨细胞早期行为的影响。与Glass相比,CH3和OH表面明显下调而NH2明显上调成骨细胞的FSS响应阀值和破坏阀值。CH3和OH表面细胞的FSS响应阀值低于5 dynes/cm2,破坏阀值介于12-20 dynes/cm2;而NH2表面细胞的响应阀值介于5-12 dynes/cm2,破坏阀值高于20 dynes/cm2。FSS响应阀值和破坏阀值对表面化学的依赖性与不同化学表面上成骨细胞的黏着斑和F-actin骨架状态密切相关。②采用RGDS抑制黏着斑形成后再施加PFSS刺激,各化学表面成骨细胞的PGE2释放大幅度降低,且不再具有表面化学依赖性;ATP和NO释放有一定程度的降低,提示FSS介导的PGE2释放依赖于黏着斑,这与文献报导是一致的。③采用细胞松弛素B阻断F-actin后施加PFSS刺激,各化学表面成骨细胞的NO释放量大幅度降低,且不再具有表面化学依赖性;ATP和PGE2释放量有一定程度的降低,提示NO释放依赖于完整的细胞骨架,这与文献报道是一致的。④同时抑制黏着斑形成和阻断F-actin后施加PFSS,所有化学表面成骨细胞几乎都不再释放ATP、NO和PGE2。⑤当成骨细胞黏着斑和F-actin同时被损以后,表面化学不再影响细胞对PFSS的响应,细胞对PFSS也不再产生响应。结合前述表面化学和不同大小FSS共刺激对成骨细胞行为的影响,可以得出共刺激对成骨细胞行为的调控机制:表面化学通过调控成骨细胞黏着斑和F-actin细胞骨架结构,调控成骨细胞对FSS的敏感性(FSS响应阀值)和耐受能力(FSS破坏阀值),继而调控成骨细胞对表面化学-FSS共刺激的响应。针对不同的FSS大小,需结合成骨细胞的敏感性和耐受能力选择合适的支架表面化学,为成骨细胞提供最优的生化反应器,实现功能性骨组织的快速形成。