论文部分内容阅读
研究背景应激条件下,肿瘤细胞会进入休眠(dormancy or quiescence),当外界环境合适时,休眠肿瘤细胞会重新活化进入增殖周期,导致复发和转移。但是目前关于肿瘤细胞进入休眠调控机制仍不清楚。肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)是肿瘤组织内一群能自我更新和分化的肿瘤细胞,是肿瘤耐药、复发和转移的根源。研究表明CSCs与休眠密切相关,大部分CSCs处于休眠期,但“干性”与“休眠”之间的相互关系尚不明确,诱导“休眠”的信号是否会同时诱导“干性”表型?这方面研究尚鲜有报道。增殖的肿瘤细胞具有独特的代谢以及酸碱调节特点。增殖的肿瘤细胞主要通过有氧糖酵解(即Warburg Effect),产生能量。虽然糖酵解会使胞内酸性产物增多,但是肿瘤细胞通过增强钠氢交换体(NHE1)活性加大H+外排能力,从而使胞内偏碱性而胞外偏酸性,最终造成翻转的(与正常细胞相比)胞内外酸碱梯度。但休眠肿瘤细胞中,代谢及酸碱梯度呈现怎样的特点,以及其对休眠的调控作用尚不清楚。MCM7是复制前复合体的一员,参与起始复制和延伸DNA,与增殖密切相关。近期研究表明,MCM7可作为转录因子和共转录因子,参与表观遗传调控。在休眠中的作用尚未见报道。研究目的1.明确休眠在肿瘤细胞耐药中的作用,初步探讨休眠与干性表型之间的相互关系;2.明确休眠肿瘤干细胞酸碱调节及pHi特点,阐明酸性pHi促进休眠的机制;3.明确MCM7缺失在肿瘤细胞休眠中的作用。研究方法和结果1.紫杉醇筛选获得休眠肿瘤干细胞:紫杉醇(IC50浓度)处理HepG2细胞(40nM)和UMUC-3细胞(80nM),获得休眠且具有“干性”肿瘤细胞。降低紫杉醇浓度,休眠CSCs重新增殖,且具有多重耐药性,但低表达“干性”标记。再次提高紫杉醇浓度,耐药细胞迅速地(3d)重新进入休眠,但此时“干性”未明显增加,继续加压筛选一段时间后(>7d)获得休眠“干性”表型。2.休眠细胞胞内偏酸性,总蛋白泛素化水平升高:BCECF,AM试剂盒检测发现休眠细胞pH;降低,NHE1表达减少;NHE1抑制剂Cariporide处理增殖细胞后,能降低pH;并抑制细胞增殖;Western-Blot检测发现在休眠过程中,总蛋白泛素化水平升高;而蛋白酶体抑制剂MG-132处理后,耐药细胞在紫杉醇诱导下无法进入休眠,且凋亡显著增加。3.休眠肿瘤细胞通过泛素蛋白酶体系统降解MCM7,抑制E2F1活性:westem-blot检测发现在休眠过程中,MCM7表达减少;MG-132处理后,MCM7降解减少;免疫沉淀MCM7,在休眠中MCM7泛素化水平升高,并且与E2F1结合减少;在休眠过程中,ChIP检测E2F1的转录活性下降;干扰MCM7表达,能抑制E2F1转录活性,E2F1调控基因cyclin D1,cyclin E1表达下降;缺失MCM7能抑制休眠再活化4.干扰MCM7能抑制CDK1活性,促进Cohesin/RAD21降解,加速有丝分裂退出:双胸苷同步细胞在G1/S期,换成正常培养基,发现MCM7在整个细胞表达稳定,并稳定结合在染色质上;Nocodazole阻断细胞在M期,干扰MCM7后,发现p-CDK1升高,Cohesin/RAD21减少,细胞退出M期时间减少,并且异常有丝分裂增多。研究结论1.肿瘤细胞进入休眠并随后发生转化获得“干性”抵抗紫杉醇杀伤;2.酸性胞内环境会激活UPS,促进周期相关蛋白降解,促进肿瘤细胞进入休眠;3.MCM7的降解,一方面抑制E2F1活性,阻止细胞进入分裂周期;另一方面能抑制CDK1活性,促进Cohesin/RAD21降解,加速退出分裂周期。